一种CSFV-E2抗体的阻断ELISA检测试剂盒及检测方法与流程

本技术涉及生物检测的，具体涉及一种csfv-e2抗体的阻断elisa检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、猪瘟(classical swine fever，csf)是由猪瘟病毒(classical swine fevervirus，csfv)引起的猪的一种高度接触性传染病，该传染病以高热和全身广泛性出血为主要特征，能导致猪群的大规模发病和死亡，严重危害我国养猪业的发展。

2、疫苗免疫接种是猪瘟防控的重要措施，其中，猪瘟兔化弱毒疫苗(c株)被认为是最有效的猪瘟疫苗之一，猪瘟c株疫苗的广泛应用对于控制猪瘟流行起到了关键作用。但是，该类疫苗免疫并未彻底阻断csfv的传播；并且在生产实践中，常因免疫程序不合理造成免疫失败，导致了猪瘟流行呈现典型和非典型猪瘟共存、免疫耐受和带毒综合征共存等现象。因此，定期开展猪群免疫水平监测分析以清除免疫水平低下的猪，对控制猪瘟流行和猪瘟净化具有十分重要的意义。

3、目前，猪瘟抗体检测的方法主要有荧光抗体中和试验(fvnt)和酶联免疫法(elisa)。其中，fvnt可作为猪瘟抗体检测的金标准，但该检测方法对试验条件和操作人员要求高，且耗时长，仅适合专业实验室进行少量样本检测，不宜推广应用。而elisa法操作简单，特异性强、灵敏度高、重复性好，可同时检测多个样品，且结果可靠，是目前国际上承认的唯一适合大规模应用的血清学检测方法。

4、目前，elisa抗体检测方法包括间接elisa、阻断elisa和化学发光elisa等，以上方法已被广泛应用于临床实践中的猪瘟抗体水平监测。但是，上述elisa抗体检测方法主要系将猪瘟病毒重组e2蛋白(csfv-e2)直接包被于酶标板，因蛋白表达系统的差异，使得检测方法的敏感性和特异性较差。

技术实现思路

1、为了提高csfv-e2抗体检测方法的敏感性和特异性，本技术提供一种csfv-e2抗体的阻断elisa检测试剂盒及检测方法。

2、第一方面，本技术提供一种csfv-e2抗体的阻断elisa检测试剂盒。

3、一种csfv-e2抗体的阻断elisa检测试剂盒，包括包被捕获抗体的酶标板、标准抗原、酶标记抗体；

4、所述捕获抗体为csfv-e2蛋白7c9株单克隆抗体；

5、所述标准抗原为杆状病毒表达的csfv-e2蛋白抗原；

6、所述酶标记抗体为酶标记的csfv-e2蛋白6e12株单克隆抗体。

7、本技术利用csfv-e2蛋白7c9株单克隆抗体作为包被于酶标板中的捕获抗体，进行捕获标准抗原，形成固相抗原；然后利用酶标记的csfv-e2蛋白6e12株单克隆抗体作为待测血清样品中csfv-e2抗体的竞争性抗体，获得了检测敏感性较高、特异性较强、重复性较好的csfv-e2抗体的检测试剂盒。

8、本技术基于间接捕获包被的原理，将固相化抗原远离载体表面，使得抗原决定簇得以充分暴露；同时间接包被的抗原经捕获抗体的亲和层析作用，使得包被在固相上的标准抗原纯度大大提高，从而有效提高了检测方法的敏感性和特异性。

9、优选地，所述标准抗原的制备方法为：从猪瘟兔化弱毒株(c株)中提取病毒核酸，通过rt-pcr扩增e2基因，并克隆至pfastbachta载体中，构建重组质粒pfastbachta-csfv-e2，利用bac-to-bac杆状病毒表达系统，将重组质粒转入dh10bac进行转座，获得含e2基因的重组bacmid，提取重组bacmid转染sf9昆虫细胞，制备了表达e2蛋白的重组杆状病毒rbv-csfv-e2株，采用ni柱亲和层析对表达的重组e2蛋白进行纯化，得到杆状病毒表达的csfv-e2蛋白抗原，即为本技术使用的标准抗原。

10、e2囊膜糖蛋白是csfv的主要结构蛋白，位于猪瘟病毒粒子外表面，能够诱导机体产生csfv的中和抗体，具有优异的活性和免疫原性，是免疫猪免受csfv攻击的主要保护性抗原蛋白。因此，e2糖蛋白是建立csfv血清学检测方法的首选抗原。

11、在本技术中，申请人将csfv的e2基因克隆入杆状病毒表达系统中，获得体外表达的重组e2蛋白，并将纯化的重组e2蛋白作为标准抗原，以建立csfv-e2抗体的检测方法。与原核表达的蛋白相比，利用杆状病毒表达的外源蛋白更加接近真实的天然蛋白的空间构象和功能。因此，本技术利用杆状病毒表达的蛋白作为标准抗原，能够使得抗原与待检猪血清中抗体的结合具有更强的特异性和敏感性。

12、优选地，所述检测试剂盒还包括阳性对照血清、阴性对照血清、样品稀释液、酶标记抗体稀释液、洗涤液、封闭液、tmb底物液、终止液。

13、进一步地，所述捕获抗体的包被浓度为1-4μg/ml；所述标准抗原的包被浓度为0.1-0.4μg/ml。

14、在一个具体的实施方案中，所述捕获抗体的包被浓度可以为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml。

15、在一些具体的实施方案中，所述捕获抗体的包被浓度还可以为1-2μg/ml、2-4μg/ml。

16、在一个具体的实施方案中，所述标准抗原的包被浓度可以为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml。

17、在一些具体的实施方案中，所述标准抗原的包被浓度还可以为0.1-0.2μg/ml、0.2-0.4μg/ml。

18、经过试验分析可知，当捕获抗体的包被浓度达到1-4μg/ml时，同一包被浓度的标准抗原的od450nm值变化不大，表明捕获抗体在酶标板上吸附达到饱和。同时，当标准抗原的包被浓度为0.1-0.4μg/ml时，od450nm值为1.0左右。因此，本技术将捕获抗体和标准抗原的包被浓度控制在上述范围。

19、进一步地，所述酶标记抗体的稀释度为1∶(6000-10000)。

20、在一个具体的实施方案中，所述酶标记抗体的稀释度可以为1∶6000、1∶8000、1∶10000。

21、在一些具体的实施方案中，所述酶标记抗体的稀释度还可以为1∶(6000-8000)、1∶(8000-10000)。

22、经过试验分析可知，当控制酶标记抗体的稀释度为上述范围时，阴性对照血清od450nm值/阳性对照血清od450nm值(n/p值)较大。因此，本技术将酶标记抗体的稀释度控制为上述范围。

23、可选的，待检血清样品进行检测时，所述待检血清样品的稀释度为1∶(1-3)。

24、在一个具体的实施方案中，所述待检血清样品的稀释度可以为1∶1、1∶2、1∶3。

25、在一些具体的实施方案中，所述待检血清样品的稀释度还可以为1∶(1-2)、1∶(2-3)。

26、经过试验分析可知，当控制待检样品的稀释度为上述范围时，n/p值较大。因此，本技术将待检样品的稀释度控制为上述范围。

27、进一步地，所述tmb底物液的反应时间为10-15min。

28、在一个具体的实施方案中，所述tmb底物液的反应时间可以为10min、15min。

29、经过试验分析可知，当控制tmb底物液的反应时间为上述范围时，n/p值较大。因此，本技术将tmb底物液的反应时间控制为上述范围。

30、进一步地，所述样品稀释液为0.4-0.6wt％pbsa。

31、进一步地，所述酶标记抗体稀释液为含有0.18-0.22wt％蔗糖、浓度为0.4-0.6wt％的pbsa。

32、进一步地，所述封闭液为2.5-3.5wt％bsa。

33、进一步地，所述终止液为1.8-2.2mol/l硫酸。

34、优选地，所述检测试剂盒还包括抗原保护液；

35、所述抗原保护液包括以下重量份的组分：90-110份丙三醇、8-12份海藻糖、0.08-0.12份谷氨酸钠、0.04-0.06份重组大肠杆菌硫氧还蛋白、850-950份水。

36、本技术利用上述抗原保护液对标准抗原进行保护，有效提高了检测方法的稳定性。

37、进一步地，所述抗原保护液还包括谷氨酸；所述谷氨酸与所述丙三醇的重量比为(0.4-0.8)∶100。

38、经过试验分析可知，相比于使用甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸中的任意一种，本技术选择使用谷氨酸添加于抗原保护液中，能够进一步提高检测方法的稳定性。因此，本技术选择使用谷氨酸添加于抗原保护液中。

39、在一个具体的实施方案中，所述谷氨酸与所述丙三醇的重量比可以为0.4∶100、0.6∶100、0.8∶100。

40、在一些具体的实施方案中，所述谷氨酸与所述丙三醇的重量比还可以为(0.4-0.6)∶100、(0.6-0.8)∶100。

41、经过试验分析可知，当控制谷氨酸与丙三醇的重量比为上述范围时，能够进一步提高检测方法的稳定性。因此，本技术将谷氨酸与丙三醇的重量比控制为上述范围。

42、第二方面，本技术提供一种csfv-e2抗体的阻断elisa检测方法，所述检测方法是基于上述csfv-e2抗体的阻断elisa检测试剂盒获得的。

43、优选地，所述检测方法包括以下步骤：

44、(1)抗体包被：用碳酸盐缓冲液将所述捕获抗体稀释，在酶标板中每孔加入80-120μl，置2-8℃包被14-20h，弃去包被液；

45、(2)洗涤：每孔加入所述洗涤液进行洗涤，弃去孔中液体，拍干；

46、(3)封闭：每孔加入所述封闭液180-220μl，37℃封闭1.5-2.5h，弃去封闭液，按照步骤(2)的方法进行洗涤；

47、(4)抗原包被：用pbst将所述标准抗原稀释，在酶标板中每孔加入80-120μl，置37℃包被50-70min，弃去孔中液体，按照步骤(2)的方法进行洗涤；

48、(5)保护：每孔加入所述抗原保护液64-144μl，37℃保护50-70min，弃抗原保护液，干燥；

49、(6)加样：利用所述样品稀释液分别将所述阳性对照血清、所述阴性对照血清、所述待测血清样品进行稀释，每孔加入80-120μl进行孵育，之后弃去孔中液体，按照步骤(2)的方法进行洗涤；

50、(7)抗体孵育：利用所述酶标记抗体稀释液将所述酶标记抗体进行稀释，每孔加入80-120μl进行孵育，之后甩干，按照步骤(2)的方法进行洗涤；

51、(8)显色：每孔加入所述tmb底物液80-120μl，置25℃进行显色反应；

52、(9)终止：每孔加入所述终止液40-60μl，终止反应；

53、(10)读数：用酶标仪读出各孔在450nm波长处吸光度值。

54、根据上述检测方法得到的roc曲线分析结果，csfv-e2抗体的阻断elisa检测方法中阻断率(pi值)的最佳临界值(cut-off值)为40％，特异性为100％，敏感性为97.0％，约登指数为0.970，roc曲线下面积为0.993。即，本技术提供的csfv-e2抗体的阻断elisa检测方法具有较强的敏感性和特异性。

55、优选地，待测血清样品中csfv-e2抗体的判定方法为：

56、当所述待测血清样品pi值≥40％，待测血清样品中csfv-e2抗体的检测结果判为阳性；

57、当所述待测血清样品pi值＜40％，待测血清样品中csfv-e2抗体的检测结果判为阴性。

58、综上所述，本技术的技术方案具有以下效果：

59、本技术基于间接捕获包被的原理，利用csfv-e2蛋白7c9株单克隆抗体作为包被于酶标板中的捕获抗体，进行捕获标准抗原，形成固相抗原；然后利用酶标记的csfv-e2蛋白6e12株单克隆抗体作为待检样品的竞争性抗体，获得了一种csfv-e2抗体的阻断elisa检测试剂盒。

60、本技术利用提供的csfv-e2抗体的阻断elisa检测试剂盒，通过对捕获抗体包被浓度、标准抗原包被浓度、酶标记抗体稀释度、显色时间等参数条件进行优化，获得了敏感性较高、特异性较强、重复性较好的csfv-e2抗体的阻断elisa检测方法。

61、本技术利用丙三醇、海藻糖、谷氨酸钠、重组大肠杆菌硫氧还蛋白、水作为抗原保护液对标准抗原进行保护，有效提高了csfv-e2抗体检测方法的稳定性。另外，本技术在抗原保护液中加入谷氨酸，并筛选谷氨酸与丙三醇的重量比，进一步提高了检测方法的稳定性。