一种活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底及其制备方法和在检测微囊藻毒素中的应用

1.本发明属于微囊藻毒素检测技术领域，具体涉及一种活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底及其制备方法和在检测微囊藻毒素中的应用。


背景技术：

2.表面增强拉曼光谱(surface-enhanced raman spectroscopy，sers)已成为一种强大的指纹识别方法，可以快速、无标记、无损地识别不同的化学和生物分析物，sers经过四十多年的研究，已经在各种领域都有广泛的发展与应用。如何能通过简单的加工制备手段、低成本化的生产具有高特异性、高灵敏性的sers基底，是目前研究者们关注的重要课题之一。
3.微囊藻毒素(microcystis,mc)是水体中分布较为广泛的藻类产生的一种具有肝脏毒性的生物毒素，具有多种同分异构体，其中存在最普遍且危害最严重的是微囊藻毒素lr(microcystin-lr,mc-lr)。由于检测时水体复杂，干扰成分较多，且mc-lr的浓度常常也低于10μg/l，在mc-lr的检测过程中，大型仪器检测方法虽然灵敏度高，结果准确，但是还存在设备昂贵、精度低、不稳定、需要有经验的操作人员、适用性差等问题。
4.因此，制备一种用于检测微囊藻毒素lr的特异性表面增强拉曼基底，对于提高水环境中微囊藻毒素lr残留检测灵敏度和准确性十分必要。为此，本发明采用表面印迹及表面增强拉曼技术，提供一种检测水环境中的微囊藻毒素lr的新型活性碳量子点复合纳米银拉曼基底的制备方法。
5.目前检测微囊藻毒素lr的特异性表面增强拉曼基底有固体型的多孔阵列电磁场增强sers器件(cn201710317198.x)，该器件裸露出的薄膜层及其上的金属层分别具有阵列排布的上下通孔用于增强；cn201110343901.7中制备了连接有微囊藻毒素的单克隆抗体的磁颗粒，用于sers的信号放大；本发明用新型量子点材料掺杂纳米银作为增强基底，能得到高达104数量级的信号强度，比现有技术相比能得到更高的信号强度，且相对于单克隆抗体的颗粒(cn201110343901.7)稳定性更好，更有利于水环境中痕量微囊藻毒素的检测。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底(agnps@cqds)的制备方法。
7.本发明的另一目的在于提供一种上述制备方法制备得到的活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底。
8.本发明的又一目的在于提供一种上述活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底在检测水环境中微囊藻毒素的应用，特别是在检测水环境中微囊藻毒素lr(mc-lr)的应用。
9.本发明的目的通过下述技术方案实现：
10.一种活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底的制备方法，包括以下操作步骤：
11.a、碳量子点粉末(cqds)的制备；
12.b、20～30nm的纳米银(agnps)的制备；
13.c、活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底(agnps@cqds)的制备。
14.优选的，步骤a所述碳量子点粉末(cqds)是由活性炭和硝酸溶液进行水热反应后得到，具体按照以下步骤制备得到：将活性炭和硝酸溶液在磁力搅拌条件下进行加热回流反应，反应结束后收集悬浮液，将悬浮液冷却至室温，采用0.45μm滤膜进行过滤，用一级水进行多次离心清洗至ph为7，离心浓缩后，通过减压蒸馏干燥，粉碎过150～250目筛，得到活性碳量子点粉末。
15.所述硝酸溶液的浓度为8mol/l；所述活性炭和硝酸溶液的用量按照质量体积比(10g～50g)：1l，优选为(30g～35g)：1l；所述加热回流反应的温度为80～140℃，优选为110～130℃；反应时间为10～60min，优选为30min。
16.所述的活性炭可以是使用其他有机物作为碳源。
17.优选的，步骤b所述20～30nm的纳米银是由ag@nps种液作为种子生长制备得到，具体按照以下步骤：向装有磁子的小烧杯加入1.5ml浓度为2.5
×
10-3
mol/l的硝酸银溶液、10mlag@nps种液和1ml浓度为1mol/l的pvp溶液，在冰水浴中搅拌均匀后加入1.5ml浓度为2.5
×
10-3
mol/l的柠檬酸钠溶液；再逐滴加入0.4ml浓度为0.1mol/l的硼氢化钠溶液，滴加中一直不断进行搅拌反应，反应结束后将反应液转移到离心管放入离心机室温下进行离心，离心后去除上清液，用去离子水反复洗涤2-3次后得到20～30nm的纳米银。本步骤中使用到的玻璃仪器必须用王水浸泡后洗涤干净。
18.更加优选的，所述ag@nps种液按照以下制备方法制备得到：向装有磁子的小烧杯加入1ml浓度为2.5
×
10-3
mol/l的硝酸银溶液和1ml浓度为1mol/l的pvp溶液，在冰水浴中搅拌均匀后加入1.5ml浓度为2.5
×
10-3
mol/l的柠檬酸钠溶液；再逐滴加入0.16ml浓度为0.1mol/l的硼氢化钠溶液，滴加中一直不断进行搅拌反应，反应结束后将反应液转移到离心管放入离心机室温下进行离心，离心后去除上清液，用去离子水反复洗涤2-3次后得到8～12nm银纳米颗粒种液，即ag@nps种液。本步骤中使用到的玻璃仪器必须用王水浸泡后洗涤干净。
19.优选的，步骤c所述活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底是以步骤b所得20～30nm的纳米银作为结晶中心，与硝酸银溶液、步骤a所得碳量子点粉末和还原剂一起通过种子生长法制备得到；所述碳量子点粉末与硝酸银溶液中银元素的质量比为1：1～10；所述还原剂为葡萄糖溶液、硼氢化钠溶液、抗坏血酸溶液或双氧水溶液。
20.更加优选的，所述活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底具体按照以下方法制备得到：将步骤a所得碳量子点粉末和硝酸银溶液混合搅拌5min，调节ph调至9，加入步骤b所得20～30nm的纳米银，随后在120℃搅拌15min后，在沸腾的溶液中加入还原剂，煮沸20min，使银离子被还原剂还原；停止加热，继续搅拌至冷却至室温；随后，将冷却后的混合物以12000rmp离心10min 3次；最后将所得沉淀重新分散到超纯水中，即为活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底；所述碳量子点粉末与硝酸银溶液中银元素的质量比为1：8～9。
21.一种由上述的制备方法制备得到的活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底。本发明提供的活性碳量子点复合纳米银的分子印迹拉曼增强基底，其结构为先以一定粒径大小的纳米银颗粒为生长晶种，再在外层聚合上碳量子点并调控纳米银颗粒的生长，形成以纳
米银粒子为内芯，碳量子点为外层的聚合物。
22.上述的活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底作为表面增强拉曼光谱材料在检测微囊藻毒素中的应用，所述应用是先将含有微囊藻毒素的水体进行固相萃取前处理，再采用活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底进行检测。
23.本发明的原理：
24.表面增强拉曼技术(sers)是一种强大的高速检测技术，它通过超高灵敏度检测提供分子指纹识别信息，通过引入简单的前处理技术，使sers的检测可以有效克服复杂基质干扰的限制，可以进一步提高检测的灵敏度。碳量子点(graphene quantum dots，cqds)结构上表现为尺寸粒径在1～10nm的准球形零维纳米粒子组成，碳基量子点具有和传统金属基量子点相似的尺寸、性质和光活性，同时也具有非毒性(生物相容性)、抗光漂白性、水溶性、成本低廉、合成简单等无机半导体量子点无法比拟的优点。本发明将表面增强拉曼技术与碳量子点结合时，可以得到高特异性、高灵敏度的新型sers基底，实现对mc-lr拉曼信号的高度响应，同时将拉曼光谱检测(sers技术)与固相萃取前处理技术相结合，实现对复杂基质中微囊藻毒素lr的分离富集，以避免复杂基质对特定拉曼信号的干扰，实现对复杂基质中mc-lr的快速检测。
25.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
26.(1)本发明借助碳量子点纳米材料，调控纳米银生成的复合sers增强基底形成，相对于单一的增强基底如纳米金、纳米银等增强基底可以有效提高sers响应信号强度；
27.(2)在增强sers响应信号同时还能使增强基底更加稳定，防止纳米银颗粒的聚集，增长基底保质期限。
28.(3)本发明结合固相萃取前处理技术可实现对复杂基质中mc-lr的快速富集和分离，并提高了sers检测的特异性，可以实现对微囊藻毒素lr的快速灵敏检测。
附图说明
29.图1为实施例1中agnps@cqds的扫描电镜图。
30.图2为实施例1中20～30nm的纳米银的扫描电镜图。
31.图3为实施例1中ag@nps种液的扫描电镜图。
32.图4本发明agnps@cqds基底的制备及对微囊藻毒素-lr的sers检测应用示意图。
33.图5为本发明的sers强度与mc-lr不同浓度所绘制的线性关系图。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
35.以下制备实施例得到的产物agnps@cqds扫描电镜图如图1所示，为外层为碳点包覆且中心是粒径在100nm左右的ag的复合材料颗粒。而制备最终产物agnps@cqds中所使用的20～30nm的纳米银扫描电镜图如图2所示，为平均粒径为24.2nm的球形颗粒，具体按照以下步骤制备得到：向装有磁子的小烧杯加入1.5ml浓度为2.5
×
10-3
mol/l的硝酸银溶液、10mlag@nps种液和1ml浓度为1mol/l的pvp溶液，在冰水浴中搅拌均匀后加入1.5ml浓度为
2.5
×
10-3
mol/l的柠檬酸钠溶液；再逐滴加入0.4ml浓度为0.1mol/l的硼氢化钠溶液，滴加中一直不断进行搅拌反应，反应结束后将反应液转移到离心管放入离心机室温下进行离心，离心后去除上清液，用去离子水反复洗涤2-3次后得到20～30nm的纳米银。本步骤中使用到的玻璃仪器必须用王水浸泡后洗涤干净。
36.上述ag@nps种液扫描电镜图如图3所示，为球形颗粒且具有较均匀的尺寸，平均粒径约为9.6nm，按照以下制备方法制备得到：向装有磁子的小烧杯加入1ml浓度为2.5
×
10-3
mol/l的硝酸银溶液和1ml浓度为1mol/l的pvp溶液，在冰水浴中搅拌均匀后加入1.5ml浓度为2.5
×
10-3
mol/l的柠檬酸钠溶液；再逐滴加入0.16ml浓度为0.1mol/l的硼氢化钠溶液，滴加中一直不断进行搅拌反应，反应结束后将反应液转移到离心管放入离心机室温下进行离心，离心后去除上清液，用去离子水反复洗涤2-3次后得到8～12nm银纳米颗粒种液，即ag@nps种液。本制备步骤中使用到的玻璃仪器必须用王水浸泡后洗涤干净。
37.以下应用实施例中应用示意图如图4所示，在完成agnps@cqds基底的制备后，通过固相萃取对待测液进行前处理，最后将所得浓缩液与agnps@cqds基底反应后进行sers检测，具体步骤如下：
38.步骤1、采用沉淀聚合法制备mc-lr分子印迹聚合物mips：首先取0.05～0.5mmol mc-lr作为模板分子与0.2～5mmol的功能单体丙烯酸(am)共同混合并分散于2～20ml乙腈溶液，将混合溶液放入4℃冰箱预聚合15～60min。当预聚合结束后，在混合溶液逐次中添加4～50mg引发剂偶氮二异丁基(aibn)和2～15mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(edgma)，后进行振荡混匀，超声20min至分散均匀。在通入氮气条件下，将混合溶液除氧5min后用封口膜密封。密封后放入恒温振荡器中进行反应聚合，反应温度设置为60℃，且震荡保持6～18h进行聚合。聚合完成后，取出反应物冷却至室温后取出，置于培养皿干燥，干燥后研磨过200目筛，并收集产物。用洗脱液进行索氏提取洗脱6～32h。将洗脱后的产物用乙醇及水反复离心洗涤三次除去残留的模板分子，确保产物洗脱完全。再将产物经过真空干燥后收集即可得mc-lr分子印迹聚合物mips。优选的，步骤1中所述功能单体丙烯酸可以是甲基丙烯酸(maa)，所述的洗脱液可以为不同体积比的甲醇、乙醇、乙腈等有机基底与不同酸(甲酸、乙酸等)的混合溶液，更加优选为体积比8:2的甲醇和乙酸混合溶液。
39.步骤2、制备mc-lr分子印迹固相萃取柱的制备方法如下：将1ml移液注射器管掏空后，在其底部封堵脱脂棉，称取200～500mg的步骤1所制备的mc-lr分子印迹聚合物mips作为填料进行装柱，装柱方法为湿法装柱。将200～500mg的填料加入下端封堵的柱体内并加入一定体积的甲醇作为匀浆液，最后用甲醇冲洗后氮气吹干备用，得到mc-lr分子印迹固相萃取小柱。优选的，步骤2中固相萃取柱的填料优选取200mg。
40.步骤3、用步骤2得到的mc-lr分子印迹固相萃取小柱作为萃取柱对水环境中mc-lr的分离和富集以得到浓缩液。步骤如下：先进行萃取柱的活化，淋洗过程中水和甲醇作为淋洗液，先用1～5ml水对萃取柱进行淋洗，紧接着用1～5ml甲醇分子淋洗，平衡过程中水作为平衡液，再紧接着用3～5ml的水进行萃取前的平衡。平衡完成后将一定体积含有mc-lr的待测溶液加入到萃取柱内，进行mc-lr分子印迹固相萃取，完成对水环境中mc-lr的富集，用优选的洗脱液对印迹聚合物中吸附的mc-lr淋洗下来。收集洗脱液后氮吹法进行浓缩，浓缩后用甲醇稀释至0.5～2ml，完成相应的浓缩并收集浓缩液在-20℃避光保存，以便后续sers检测。优选的，步骤3中上样溶液的流速为1ml/min。优选的mc-lr分子印迹固相萃取的条件如
下：上样液为含有5mg/l mc-lr的待测溶液，上样体积为2ml；淋洗液依次为3ml水和3ml甲醇；洗脱液为甲醇乙酸混合溶液(v/v＝4:1)，洗脱液的体积为2ml。
41.步骤4、采用手持式拉曼光谱仪进行sers检测，取步骤3中一定体积的浓缩液加入离心管，再取200～1000μl agnps@cqds基底加入到离心管并混合摇匀，孵育5～20min后进行sers测试。优选的，步骤4中sers测试条件为：agnps@cqds基底和浓缩液体积比为2:8，激发波长为785nm，激光功率为75mw～350mw(优选125mw)，扫描时间为(优选5000ms)，扫描范围为100cm-1
～2400cm-1
(优选600cm-1
～1700cm-1
)。前述的sers检测，因mc-lr在1457cm-1
处的线性关系较好，所以选择1457cm-1
处的拉曼位移作为浓度计算的信号相应峰，样品溶液中微囊藻毒素lr的线性检测范围在0.334～20μg/l，检出限为0.0407μg/l。优选的，在步骤3中也可选用现有其他规格的mc-lr固相萃取小柱进行检测步骤4。
42.制备实施例1：
43.活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底的制备：
44.1、将5g活性炭和150ml硝酸溶液(8mol/l)加入到三颈烧瓶中，加入四氟乙烯磁力搅拌转子，磁力搅拌条件下进行加热130℃回流反应，反应结束后收集悬浮液，将悬浮液冷却至室温，采用0.45μm滤膜进行过滤，用一级水进行多次离心清洗至ph为7，离心浓缩后，通过减压蒸馏干燥，粉碎过150～250目筛，得到活性碳量子点粉末，即cds粉末；2、取上述步骤1所得cds粉末用一级水配置为浓度为5mg/ml的cds溶液；将300ml所得cds溶液和120ml agno3(1mol/l)加入500ml烧杯中，将溶液搅拌5min；然后用0.1mol/l的naoh溶液将溶液的ph调至9左右，加入10ml粒径在20～30nm的纳米银溶液；随后，溶液在120℃搅拌15min后，在沸腾的溶液中快速加入80ml葡萄糖溶液(90mg/ml)；煮沸20min，使银离子被葡萄糖还原。停止加热，使溶液自然冷却到至室温，同时继续搅拌；随后，将冷却后的混合物以12000rmp离心10min 3次；最后，将所得agnps@cqds重新分散到10ml超纯水中，得到活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底，即agnps@cqds基底，并保存于4℃条件下备用。
45.制备实施例2：
46.活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底的制备：
47.1、将50g活性炭和1000ml硝酸溶液(8mol/l)加入到三颈烧瓶中，加入四氟乙烯磁力搅拌转子，磁力搅拌条件下进行加热130℃回流反应，反应结束后收集悬浮液，将悬浮液冷却至室温，采用0.45μm滤膜进行过滤，用一级水进行多次离心清洗至ph为7，离心浓缩后，通过减压蒸馏干燥，粉碎过150～250目筛，得到活性碳量子点粉末，即cds粉末；2、取上述步骤1所得cds粉末用一级水配置为浓度为5mg/ml的cds溶液；将300ml所得cds溶液和120ml agno3(1mol/l)加入500ml烧杯中，将溶液搅拌5min；然后用0.1mol/l的naoh溶液将溶液的ph调至9左右，加入10ml粒径在20～30nm的纳米银溶液；随后，溶液在120℃搅拌15min后，在沸腾的溶液中快速加入80ml葡萄糖溶液(90mg/ml)；煮沸20min，使银离子被葡萄糖还原。停止加热，使溶液自然冷却到至室温，同时继续搅拌；随后，将冷却后的混合物以12000rmp离心10min 3次；最后，将所得agnps@cqds重新分散到10ml超纯水中，得到活性碳量子点复合纳米银拉曼增强基底，即agnps@cqds基底，并保存于4℃条件下备用。
48.应用实施例1：
49.mc-lr的sers检测标准曲线的建立步骤如下：1、取1.0mg mc-lr的标准品，用1.0ml甲醇充分溶解，随后用超纯水制备出10mg/l的标准储备溶液，在4℃下避光存放；2、取200μl
制备实施例1制得的agnps@cds基底与800μl不同浓度的mc-lr标准溶液混合，mc-lr标准溶液浓度分别为0μg/l、0.3125μg/l、0.625μg/l、1.25μg/l、5μg/l、10μg/l、20μg/l；3、将混匀后的液体充分混匀后孵育15min；4、用便携拉曼光谱仪进行检测静置后的样品，每个样品进行3次平行测定，激发功率设定为用125mw，积分时间为5000ms。5、根据得到的sers强度与相应标准液浓度绘制线性关系图，如图5所示。选择1457cm-1
处的拉曼位移作为浓度计算的信号相应峰，在1457cm-1
处校正方程为y＝0.0541x+0.0235。
50.应用实施例2：
51.对实际样品的检测应用步骤如下：1、用实验室的自来水作为取样对象，取水后水样先经过0.22μm的滤膜反复过滤，直至水样澄清；2、用mc-lr储备液对其进行加标，添加mc-lr标准溶液的浓度为10μg/l；3、通过固相萃取前处理得到浓缩液；4、取400μl制备实施例1制得的agnps@cqds基底和1600μl浓缩液加入2.5ml离心管中混合摇匀，孵育20min后进行拉曼测试。5、每个水样进行3次平行测定。测试条件:激发波长为785nm，激光功率为200mw，激发时间为5000ms，扫描范围为600cm-1
～1600cm-1
；6、根据应用实施例1中矫正方程计算浓缩液中微囊藻毒素-lr浓度，此方法样品溶液中mc-lr的线性检测范围在0.334～20μg/l，检出限为0.0407μg/l。
52.应用实施例3：
53.对实际样品的检测应用步骤如下：1、用野外湖水水样作为取样对象，取水后水样先经过0.22μm的滤膜反复过滤，直至水样澄清；2、用mc-lr储备液对其进行加标，添加mc-lr标准溶液的浓度为10μg/l；3、通过固相萃取前处理得到浓缩液；4、取400μl制备实施例1制得的agnps@cqds基底和1600μl浓缩液加入2.5ml离心管中混合摇匀，孵育20min后进行拉曼测试。5、每个样品进行3次平行测定。测试条件:激发波长为785nm，激光功率为200mw，激发时间为5000ms，扫描范围为600cm-1
～1600cm-1
；5、根据应用实施例1中矫正方程计算浓缩液中微囊藻毒素-lr浓度，此方法样品溶液中mc-lr的线性检测范围在0.334～20μg/l，检出限为0.0407μg/l。
54.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。