利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测RhD抗原的方法与流程

利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测rhd抗原的方法
技术领域
1.本发明涉及一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测rhd抗原的方法，属于生物检测领域。


背景技术：

2.rh血型系统是43个血型系统中最复杂的血型系统，是仅次于abo血型系统的具有重要临床意义的血型系统，rh血型系统中又以rhd最为重要，属于临床输血前检查的必查项目。根据rhd抗原的有无，临床将红细胞区分为rhd阳性和rhd阴性两大类，其中rhd阴性在汉族人中所占比例为3-5%。rhd阴性受血者输注rhd阳性血液，会使受血者产生抗d抗体，再次输血时会产生溶血性输血反应；rhd阴性的母体在分娩rhd阳性胎儿时，也可能导致母体因胎儿的rhd阳性血而免疫，再次怀孕rhd阳性胎儿，就有可能产生胎儿新生儿溶血病。因此，正确判定rhd血型，具有重要的临床意义，属于临床输血前检查的必查项目。
3.目前通用的rhd血型鉴定方法利用抗d抗体和红细胞在体外发生凝集反应的原理，常用的方法有玻片法（纸片法）、试管法、微板法、微柱凝胶法等方法（玻片法、试管法、微板凝集法、微柱凝胶法均记载于《全国临床检验操作规程》中）。其中利用凝集反应的原理在96孔微板上进行的血型鉴定与本方案从反应载体上讲，有相似之处，但与本方案的血型鉴定原理完全不同。利用凝集反应的原理在微板上进行的rhd血型鉴定是以抗d抗体与红细胞形成的凝集块的大小判断凝集强度，从而达到区分rhd阳性和rhd阴性的目的。但是，这些方法均存在缺陷，例如：玻片法和试管法需要人工操作，费时费力，还容易产生人为误差；微板凝集法抗体和红细胞的加样量和抗体批间差异会影响结果的稳定性；微柱凝胶法在运输过程中试剂凝胶容易变形和产生气泡，影响检测结果。
4.cn113092793a提供了一种基于固相吸附的检测rh血型抗原的正定型方法，此方法为将待分型红细胞与rh血型抗体添加至包被有其他物种第二抗体的容器中进行离心后，观察待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部是否被吸附，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞与该rh血型抗体对应的rh血型抗原为阳性，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部不被吸附，则待分型红细胞与该rh血型抗体对应的rh血型抗原为阴性；此方法灵敏度高，特异性强，检测成本低，且具有易于自动化操作的优势，能避免操作过程中的人为误差。但该方法仍需通过肉眼或ccd来判定吸附情况，是一种定性检测方法，不同的人对同一个结果可能产生判别差异，机器ccd判别也容易产生误差。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测rhd抗原的方法，所述方法包含鉴定步骤；所述鉴定步骤为：将待检红细胞添加至包被有抗d抗体的容器中进行离心，离心结束后，用生理盐水洗涤微孔板3-6次，最后一次洗涤完成后用
吸水纸吸干微孔板中残余液体，加入过氧化物酶底物，利用红细胞内源性过氧化物酶显色3-20分钟，用酸性溶液终止反应2-10分钟，置酶标仪在特定波长下测定od值，根据od值的大小判定被检样本的rhd血型；若待检红细胞在包被有抗d抗体的容器检测od值均小于cutoff值，则待检红细胞的rhd血型为阴性；若待检红细胞在包被有抗d抗体的容器检测od值均大于cutoff值，则待检红细胞的rhd血型为阳性。
6.进一步的，所述离心的转速为90-360g、时间为1-30min。
7.进一步的，所述鉴定步骤前，还包含稀释步骤；所述稀释步骤为：将待检红细胞稀释至体积浓度为0.1-1%。
8.进一步的，所述稀释步骤为：用liss（低离子强度溶液）或生理盐水将待分型红细胞稀释至体积浓度为0.1-1%。
9.在本发明的一种实施方式中，所述稀释步骤为：用生理盐水将待检红细胞洗涤3-5次后，用liss或生理盐水将待分型红细胞稀释至体积浓度为0.1-1%。
10.进一步的，所述待检红细胞在包被有抗d抗体的容器中的添加量为10-100μl。
11.进一步的，所述包被有抗d抗体的容器的制备方法为：将抗d抗体用缓冲液a适当稀释后添加至容器，于2-8℃包被8-16h，得到经包被的容器；在经包被的容器中加入含有脱脂奶粉、蔗糖、tween20（吐温-20）的缓冲液b后，于37℃封闭0.5-3h，得到包被有抗d抗体的容器。
12.进一步的，所述缓冲液a为ph 7.2-9.8的碳酸盐缓冲液。
13.进一步的，所述缓冲液b为ph 6.5-8.5的pbs缓冲液；所述脱脂奶粉在缓冲液b中的质量浓度为0.1-3%；所述蔗糖在缓冲液中的质量浓度为1-10%；所述tween20在缓冲液b中的体积浓度为0.01-0.5%。进一步的，所述缓冲液c为含有tween20的ph 6.5-8.5pbs缓冲液；所述tween20在缓冲液c中的体积浓度为0.01-0.5% 。
14.进一步的，所述包被有抗d抗体的容器的制备方法包含如下步骤：包被步骤：用ph 7.2-9.8的碳酸盐缓冲液a将抗d抗体倍比稀释16-2048倍，得到稀释液；将稀释液添加至容器后，于2-8℃包被8-16h，得到经包被的容器；第一次洗板步骤：在经包被的容器中加入ph 6.5-8.5的pbs缓冲液c进行洗涤，重复洗涤1-5次，得到经洗涤的容器；封闭步骤：在经洗涤的容器中加入含有重量/体积浓度为0.1-3%的脱脂奶粉、重量/体积浓度为1-10%的蔗糖、体积浓度为0.01-0.5%的tween20的ph 6.5-8.5的pbs缓冲液b后，于37℃封闭0.5-3h，得到经封闭的容器；第二次洗板步骤：在经封闭的容器中加入ph 6.5-8.5的pbs缓冲液c（含一定体积浓度的tween20）进行洗涤，重复洗涤0-5次，得到包被有抗d抗体的容器。
15.进一步的，所述包被步骤中，先用ph 7.2-9.8的碳酸盐缓冲液a将抗d抗体稀释至16-2048倍，得到稀释液，再将稀释液添加至容器中。
16.进一步的，所述洗涤步骤为：加入ph 6.5-8.5的pbs缓冲液c（含一定体积浓度的tween20）进行洗涤，重复洗涤1-5次。
17.本发明还提供了上述方法或上述系统在检测rhd血型抗原中的应用。
18.本发明技术方案，具有如下优点：本发明提供了一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测rhd抗原的方法，此方法为将待检红细胞添加至包被有抗d抗体的容器后离心，洗涤去除没有吸附的红细胞，加入过氧化物酶底物显色，加终止液终止反应，在一定波长的滤光片下用酶标仪检测吸光度值，根据od值的大小判断被检红细胞上是否有d抗原。
19.所述方法具有易于自动化操作和稳定性高的优势，所述方法包被抗体用量少、样本红细胞经稀释后也是微量，反应结果的判定客观，具有灵敏度高和特异性强的优势。并且，所述方法摆脱对价格较高的凝胶的依赖，一个包被有抗d抗体的微孔和微量样本红细胞就可以鉴定一个样本红细胞的rhd血型，具有成本低的优势。另外，此方法与以往红细胞d抗原鉴定方法只能进行定性分析不同，可以通过检测od值对阳性结果进行定量分析，od值的大小间接反映被检红细胞上d抗原的数量多少，可以间接分析是否属于弱d以及其合子型。
附图说明
20.图1为本发明利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测rhd抗原的方法的检测原理图。
具体实施方式
21.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
22.下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
23.一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测rhd抗原的方法，参见图1，u型微孔板包被抗d抗体，加入待检红细胞离心，d抗原阳性的红细胞与抗体结合，均匀地分布在u型微孔板底部，d抗原阴性的红细胞在离心后在u型微孔板底部汇聚成一个细胞扣，经过生理盐水洗板后，均匀吸附在孔底的d抗原阳性的细胞不被洗掉，而d抗原阴性的细胞被洗掉，加入过氧化物酶底物，利用红细胞内源性过氧化物酶显色，终止反应后测定吸光度值（od值），od值的大小与微孔板底部吸附的红细胞量成正比，根据od值的大小判定相应红细胞上是否含有d抗原。
24.实施例1：一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测rhd抗原的方法所述方法包括如下步骤：（1）包被：用ph 9.6的碳酸盐缓冲液将效价512的抗d抗体倍比稀释512倍，得到含有抗d抗体的稀释液，将稀释液以每孔100μl的添加量加入u型微孔板后，于4℃包被12h，得到经包被的微孔板；（2）第一次洗板：以每孔250μl的添加量在经包被的微孔板中加入ph 7.2的pbs缓冲液c（含0.02%tween20）洗涤1次，洗涤完成后将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的
微孔板；（3）封闭：以每孔250μl的添加量分别在经洗涤的微孔板中加入含有体积浓度为0.02%的tween20、质量浓度0.2%脱脂奶粉、质量浓度5%蔗糖的ph 7.2的碳酸盐缓冲液b后，于37℃封闭2h，得到经封闭的微孔板；（4）稀释：用生理盐水将待分型红细胞洗涤3次后，用liss或生理盐水将待分型红细胞稀释至浓度为0.2%，得到待检红细胞悬液；（5）检测：以每孔40μl的添加量在经洗涤孔板中分别加入待检红细胞悬液后，于190g的转速下离心1min，得到经离心的微孔板；（6）洗涤：在微孔板中每孔加入250μl生理盐水洗涤5次，最后一次洗涤完成后用吸水纸吸干残余液体；（7）显色：每孔加入过氧化物酶底物tmb100μl，避光显色10分钟；（8）终止：每孔加入0.16m h2so
4 50μl避光静置5分钟终止反应。
25.（9）检测：将微孔板置酶标仪于450nm光波检测od值。
26.（10）取8个已知不同样本，测定od值，详情见表1。
27.表1注：+代表rh阳性；-代表rh阴性上表中od值检测结果与cutoff值=0.2比较，rhd血型阴性与阳性判定结果与样本已知结果一致。
28.实施例2一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测rhd抗原的方法（原理参见图1），所述方法包括如下步骤：（1）包被：用ph 9.3的碳酸盐缓冲液将效价512的抗d抗体倍比稀释1024倍，得到含有抗d抗体的稀释液，将稀释液以每孔100μl的添加量加入微孔板（u型）后，于2℃包被16h，得到经包被的微孔板；（2）第一次洗板：以每孔250μl的添加量在经包被的微孔板中加入ph7.8的pbs缓冲
液c（含0.05%tween20）洗涤1次，洗涤完成后将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板；（3）封闭：以每孔250μl的添加量分别在经洗涤的微孔板中加入含有体积浓度为0.2%的tween20、质量浓度0.9%脱脂奶粉、质量浓度8%蔗糖的ph7.8的碳酸盐缓冲液b后，于37℃封闭1h，得到经封闭的微孔板；（4）稀释：用生理盐水将待分型红细胞洗涤4次后，用liss或生理盐水将待分型红细胞稀释至浓度为0.5%，得到待检红细胞悬液；（5）检测：以每孔40μl的添加量在经洗涤孔板中分别加入待检红细胞悬液后，于100g的转速下离心1.5min，得到经离心的微孔板；（6）洗涤：在微孔板中每孔加入250μl生理盐水洗涤4次，最后一次洗涤完成后用吸水纸吸干残余液体；（7）显色：每孔加入过氧化物酶底物tmb100μl，避光显色8分钟；（8）终止：每孔加入0.18m h2so
4 50μl避光静置3分钟终止反应。
29.（9）检测：将微孔板置酶标仪于450nm光波检测od值。
30.（10）取8个已知不同样本，测定od值，详情见表1。
31.表2样本编号及rh血型od值cutoff值结果568(o+)2.8480.2rhd阳性569(b+)3.140.2rhd阳性570(b+)2.3950.2rhd阳性571(o+)2.7950.2rhd阳性572(o+)2.5520.2rhd阳性573(o+)3.0350.2rhd阳性574(ab+)2.1390.2rhd阳性575(ab+)3.1460.2rhd阳性注：+代表rh阳性；-代表rh阴性上表中od值检测结果与cutoff值=0.2比较，rhd血型阴性与阳性判定结果与样本已知结果一致。
32.实施例3利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测rhd抗原的方法（原理参见图1），所述方法包括如下步骤：（1）包被：用ph 9.5的碳酸盐缓冲液将效价512的抗d抗体倍比稀释128倍，得到含有抗d抗体的稀释液，将稀释液以每孔100μl的添加量加入微孔板（平底）后，于8℃包被8h，得到经包被的微孔板；（2）第一次洗板：以每孔250μl的添加量在经包被的微孔板中加入ph 7.5的pbs缓冲液c（含0.3%tween20）洗涤1次，洗涤完成后将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板；（3）封闭：以每孔250μl的添加量分别在经洗涤的微孔板中加入含有体积浓度为0.3%的tween20、质量浓度2%脱脂奶粉、质量浓度10%蔗糖的ph7.8的碳酸盐缓冲液b后，于37
℃封闭0.5h，得到经封闭的微孔板；（4）稀释：用生理盐水将待分型红细胞洗涤5次后，用liss或生理盐水将待分型红细胞稀释至浓度为1 %，得到待检红细胞悬液；（5）检测：以每孔40μl的添加量在经洗涤孔板中分别加入待检红细胞悬液后，于360g的转速下离心5min，得到经离心的微孔板；（6）洗涤：在微孔板中每孔加入250μl生理盐水洗涤5次，最后一次洗涤完成后用吸水纸吸干残余液体；（7）显色：每孔加入过氧化物酶底物tmb100μl，避光显色12分钟；（8）终止：每孔加入0.16m h2so
4 50μl避光静置9分钟终止反应。
33.（9）检测：将微孔板置酶标仪于450nm光波检测od值。
34.（10）取8个已知不同样本，测定od值，详情见表1。
35.表3样本编号及rh血型od值cutoff值结果576(b+)3.7070.2rhd阳性577(b+)3.5190.2rhd阳性578(a+)3.6640.2rhd阳性579(a+)3.6310.2rhd阳性580(ab+)3.5930.2rhd阳性581(a+)3.5120.2rhd阳性582(b-)0.0470.2rhd阴性583(o-)0.0560.2rhd阴性注：+代表rh阳性；-代表rh阴性上表中od值检测结果与cutoff值=0.2比较，rhd血型阴性与阳性判定结果与样本已知结果一致。