一种血清中游离前列腺特异抗原的定值方法与流程

本发明涉及检疫检测，特别是涉及蛋白含量的分析、测试、诊断监测、检验、检测、计量等领域，具体涉及一种血清中游离前列腺特异抗原的定值方法。

背景技术：

1、前列腺特异抗原(psa)是由237个氨基酸多肽主链和单糖侧链组成的，主体肽链分子量约为26kda的蛋白。psa是精液中最主要的蛋白质之一，在精液中含量高达0.5-3mg/ml，但在健康人体血清中含量极低。健康状态下，血清psa浓度低是由于前列腺有完整的组织屏障导致psa不能进入血液循环。当前列腺发生病变，甚至存在肿瘤会破坏前列腺组织屏障，血液psa水平会大幅升高。在血液循环中，psa以游离psa和复合psa两种形式存在。

2、临床中血清psa水平主要使用psa试剂盒进行免疫分析检测，但是在临床检测结果中发现，各种商业psa试剂盒测定的血清psa浓度值存在不可忽视的差异，这种情况归因于psa存在形式的多样性。不同厂家生产的试剂盒中使用不同抗体，而不同抗体针识别不同形式psa的抗原表位，导致临床测量结果不一致。因此，psa的标准物质及其参考测量方法的开发有助于研制检测结果稳定可靠的人血清psa检测试剂盒。大批量应用于临床检测，可以提高前列腺癌临床诊断正确率并对治疗结束后患者恢复情况进行有效评估。

3、英国国家生物制品检定所(nibsc)研制出第二代游离psa标准物质17/102，材料为人源，来自8个不同国家的10个实验室采用临床常规分析方法对候选标准物质进行联合定值，每安瓿瓶含0.53μg游离psa。但此定值方法基于免疫分析，无法溯源到si单位。

4、欧洲标准局(erm)研制出了游离psa标准物质bcr 613，材料为人源，五家单位通过对氨基酸的定量分析，准确测定psa浓度，使定量结果可溯源至si单位。氨基酸水解法相对比较成熟，其分析测定的干扰较小，但是对样品的纯度要求较高，杂质亦或是样品降解都会对其产生很大的影响，不适用于血清样品。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述问题，本发明提供了一种血清中游离前列腺特异抗原的定值方法。可以高效、简便、可靠的血清中游离前列腺特异抗原进行定值，为其他血清样品中蛋白质的定值提供参考。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

3、一种血清中游离前列腺特异抗原的定值方法，包括以下步骤：

4、(1)空白血清的选择：医院检验科抽取健康志愿者血液，血液通过血液离心机进行离心分离获得血清，使用罗氏电化学发光试剂盒和生化分析仪对血清进行免疫分析，并选择前列腺特异抗原含量为0-0.5ng/ml的血清作为空白血清。

5、(2)前列腺特异抗原纯品物质的选择：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相、和飞行时间质谱，对前列腺特异抗原进行定性分析，为后续在血清中添加选择原料。

6、聚丙烯酰胺凝胶电泳具体为，在psa溶液中加入适量溴酚蓝混匀，90℃加热5min；泳道中加入marker和样品，电压调到80v；之后将胶块用考马斯亮蓝染色，20min后用洗脱液反复洗脱，直至能看到条带。

7、液相色谱法具体为，将psa样品进质谱，查看质谱图中是否有杂峰；色谱柱为：vydac214tp c4(5μm，4.6×250mm)；流动相a：水(0.1％甲酸)，流动相b：乙腈(0.1％甲酸)；流速0.2ml/min。

8、飞行时间质谱法具体为，以饱和芥子酸溶液作为基质，吸取10μl溶液与10μl饱和芥子酸溶液于离心管中混合均匀，吸取混合液1μl滴于mtp 384靶板上，吹干后将靶板放入仪器仓中进行蛋白质分子量测定。实验采用正极性分析，检测质量范围设置为10000-40000da，脉冲离子提取时间为450ns，离子源1、离子源2电压分别为25kv、23.3kv，使用flexanalysis分析软件进行数据处理。

9、(3)血清样品制备：在500μl空白血清中加入一定量的psa，制备成为血清样品。

10、(4)血清中游离前列腺特异抗原的纯化富集：将磁珠活化，加过量抗体孵育过夜，制备磁珠抗体复合物，磁珠-抗体溶液为在10mg/ml；取血清样品于离心管中，加入50μl的磁珠抗体复合物，室温旋转孵育1h，使血清中的前列腺特异抗原结合到磁珠抗体上，去上清；用100μl 5％乙酸溶液水溶液将磁珠上结合的前列腺特异抗原洗脱下来，室温旋转孵育2分钟；用磁珠分离器吸附磁珠，收集洗脱下来的溶液，-20℃保存使用。

11、(5)酶切肽段hr、fr、lk：将洗脱液真空干燥后，加入10μl的去离子水复溶；90℃加热10分钟对蛋白质进行变性；恢复常温后，加入80μl碳酸氢铵溶液调节ph，按比例加入一定量的胰蛋白酶溶液，并加入等量的标记肽段溶液，于37℃进行酶切反应；加入甲酸终止反应；得到酶切肽段hr、fr、lk；其中，肽段hr的序列为hsqpwqvlvasr，肽段fr的序列为flrpgddsshdlmllr，肽段lk的序列为lsepaeltdavk，如seq id no:1-3所示；

12、(6)高标、低标溶液的配制：配制的高标低标溶液中特征肽段与标记特征肽段质量比约为0.8和1.2，且特征肽段浓度与psa溶液酶解后理论特征肽段浓度一致。

13、(7)前列腺特异抗原定量分析：将酶切好的样品和高低标溶液进质谱，通过肽段的浓度推算出前列腺特异抗原的浓度，而肽段的浓度根据液质分析mrm模式谱图的峰面积表示；选用3条肽段计算前列腺特异抗原浓度，以三者平均值定值；

14、根据肽段hr、fr、lk浓度计算血清中psa浓度，计算公式如下：

15、

16、式中，i为肽段，mpsa为psa相对分子质量26072.12，m为肽段相对分子质量，mis为加入内标质量，单位μg；ih为高标中肽段与内标质量之比，il为低标中肽段与内标质量之比，rh为高标中肽段或与内标峰面积之比，rl为低标中肽段与内标峰面积之比，m为psa溶液质量，单位g；chr，cfr和clk分别为由三条肽段计算得到的肽段浓度，cpsa为血清中psa的浓度。

17、同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

18、(1)本发明方法将前列腺特异抗原的单克隆抗体结合到磁珠上，通过免疫吸附的方式提取纯化血清中的前列腺特异抗原，经胰蛋白酶酶切后，用液相色谱串联质谱的方法(lc-ms/ms)对其进行定量分析。

19、(2)本发明方法无需考虑蛋白质提取率、酶切效率、仪器稳定性等因素。在样品中添加等量的内标——标记肽段，可以消除以上误差，计算得到血清样品中游离psa的浓度。通过肽段对蛋白进行定值，其数值可靠、可溯源至si单位，并且添加原料是天然psa，因此无需考虑其结构的差异。

20、(3)本发明方法是一种高效、简便、可靠的测量方法，可为其他血清样品中蛋白质的定值提供参考。

21、(4)本发明方法通过同位素稀释质谱法准确定量血清中游离psa，为人血清游离psa标准物质的研制和参考测量程序的开发提供了新思路。

22、下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的血清中游离前列腺特异抗原的定值方法作进一步说明。