一种测定水产品中克百威及其代谢物3-羟基克百威残留检测方法与流程

本发明涉及水产品检测，更具体地说，它涉及一种基于quechers提取的液相色谱-串联质谱法测定水产品中克百威及其代谢物3-羟基克百威残留的方法。

背景技术：

1、克百威又名呋喃丹，是一种高效、高毒的杀虫、杀螨和杀线虫农药，克百威及其代谢物对病虫害的作用机理是具有不可逆的抑制胆碱酯酶作用，对多种病虫害防治作用显著，目前，克百威及其代谢物在防治农作物病虫害，控制人畜传染病，提高农畜禽产品产量与质量方面起到举足轻重的作用。但是，由于克百威及其代谢物具有不可逆的抑制胆碱酯酶作用机理。在玉米、小麦等饲料作物中的克百威及其代谢物的残留可经过养殖动物摄入并通过食物链进入禽畜及人体体内富集累积，从而对禽畜及人体健康、生态环境造成危害。

2、在国标中对克百威残留量的规定是以克百威及其代谢物3-羟基克百威之和计算，残留标准中规定了几种动物源食品的最大限量规定，如哺乳动物肉类(猪、牛、羊和马，海洋哺乳动物除外)≤0.05*mg/kg、哺乳动物内脏(猪、牛、羊和马，海洋哺乳动物除外)≤0.05*mg/kg、哺乳动物脂肪(猪、牛、羊和马，海洋哺乳动物除外)≤0.05*mg/kg，另外我国规定克百威为禁止在动物中使用的药物；欧盟(eu)2015/399规定，猪、牛、羊、马等家禽类动物源食品的肉、脂肪与肝脏等的限量均为0.01*mg/kg；cac规定，猪、牛、羊、马肉及猪、牛、马脂肪中克百威限量均为0.05mg/kg，日本对鱼肉中克百威限量为0.05mg/kg。

3、目前，我国现行有效的动物源食品中药物残留的检测标准多集中在兽药残留检测方面，开展动物源食品中克百威及其代谢物等相关农药残留检测方法有gb 31658.10-2021《动物性食品中氨基甲酸酯类杀虫剂残留量的测定液相色谱－串联质谱法》、gb/t5009.163-2003《动物性食品中氨基甲酸酯类农药多组分残留高效液相色谱测定》或sn/t2560-2010《进出口食品中氨基甲酸酯类农药残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》，但都没有涉及到水产品中克百威及其代谢物3-羟基克百威的检测。与gb 2763-2021中规定，克百威残留量按“克百威及3-羟基克百威之和，以克百威表示”的规定不符合。

4、查阅相关文献发现，水产品中克百威和其代谢物3-羟基克百威的检测研究相对比较少，且所涉文献的前处理方法，多是采用固相萃取法，净化过程中，提取液需要经过固相萃取柱净化，耗费溶剂量相对较大，耗时较长，难以满足大批量样品检测的需求。

5、通过本发明，主要解决了现在标准中缺少水产品中克百威和其代谢物3-羟基克百威检测的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种测定水产品中克百威及其代谢物3-羟基克百威残留的方法，本发明主要是采用quechers前处理方法。试样用乙腈提取，通过分散固相萃取净化，采用液相色谱-质谱/质谱仪检测，外标法定量。同时quechers前处理方法，回收率高(>90％以上)，操作简便，成本低，耗费溶剂量少，环境友好，分析速度快，能在30min内完成6个样品的处理，能满足大批量样品检测的需求。

2、本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

3、一种测定水产品中克百威及其代谢物残留方法，包括以下步骤：

4、s1：试样的制备与保存；取鱼肉样品中具有代表性的可食部分500g，经组织捣碎机捣碎后充分混匀，装入洁净容器中。密封并做好标记，于-18℃以下保存。

5、s2：样品提取；称取5g鱼肉试样(精确至0.01g)置于50ml离心管中，加入10ml乙腈，用均质器以10000r/min均质20s～30s，再取10ml乙腈清洗均质器刀头上的残渣，合并乙腈提取液后，涡旋混合器上混合提取20s～30s，加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠二水合物、0.5g柠檬酸二钠盐倍半水合物，混匀后放入摇床振荡提取10min，以4000r/min离心5min，取出1ml上清液待净化。

6、s3：净化；取步骤s2中的鱼肉待净化液转移至内含除水剂和净化材料的塑料离心管中，涡旋混匀1min，以12000r/min离心5min，取上清液过0.22μm有机相微孔滤膜，供lc-ms/ms(液相色谱-质谱/质谱)测定；

7、s4:标准工作曲线的绘制

8、取空白样品按照s2及s3处理。用所得的样品溶液将克百威和3-羟基克百威混合标准溶液稀释得到的混合标准工作液，按浓度由低到高的顺序进样检测，以定量离子峰面积为纵坐标，标准工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线。

9、s5:结果计算

10、s5.1定性测定：测定试样和标准工作溶液，如果试样中待测物质的保留时间与标准工作溶液一致，保留时间偏差在±2.5％以内，并且定性离子对的相对丰度(是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示)与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表1的规定，且每个离子的信噪比均≥3，则可判断试样中存在相应的被测物。

11、表1定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

12、 相对离子丰度(基峰)/％ ＞50 20～50(含) 10～20(含) ≤10 允许的相对偏差/％ ±20 ±25 ±30 ±50

13、s5.2定量测定：对标准工作溶液和样液等体积进样测定，待测样液中克百威和3-羟基克百威的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析，根据标准曲线及供试品的峰面积，计算供试品中克百威和其代谢物3-羟基克百威的含量。

14、s5.3计算结果与表述：

15、采用外标法定量，用式(1)分别计算试样中克百威和3-羟基克百威的残留量，计算结果应扣除空白值。

16、

17、式中：

18、x——试样中克百威和3-羟基克百威残留量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

19、c——从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为微克每毫升(μg/ml)；

20、v——样液最终定容体积，单位为毫升(ml)；

21、m——最终样液代表的试样质量，单位为克(g)。

22、克百威残留物在gb 2763中定义为克百威及3-羟基克百威之和，以克百威表示。因此按式(2)计算试样中克百威的总残留量：

23、x总＝x克百威+x3-羟基克百威×0.93……………………(2)

24、式中：

25、x总——试样中以克百威表示的总残留量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

26、x克百威——试样中克百威的残留量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

27、x3-羟基克百威——试样中3-羟基克百威的残留量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

28、0.93——3-羟基克百威换算为克百威的系数。

29、计算结果保留两位有效数字，当含量超过1mg/kg时，保留三位有效数字。

30、本发明进一步设置为：所述步骤s3中，优化净化方式：比较常用的净化方式：quechers净化和spe净化。首先考虑操作简便的quechers净化方式，分别考察200mg各种净化剂(石墨化炭黑(gcb)、硅胶键合碳十八(c18)、n-丙基乙二胺(psa)、中性氧化铝、弗罗里硅土)对回收率的影响。发现5种净化粉末对克百威和3-羟基克百威均不存在明显的吸附作用，回收率均高于89％，均能满足检测需求。考虑到spe柱需要活化和洗脱程序，过程繁琐，溶剂量耗费大，因此采用更能节约溶剂，操作更为简便的quechers净化方式。同时本发明比较150mg无水硫酸镁+50mgpsa+50mgc18+25mggcb；150mg无水硫酸镁+50mgpsa+50mgc18；150mg无水硫酸镁+50mgpsa三种净化组合，150mg无水硫酸镁+50mgpsa+50mgc18回收最优，因此在塑料离心管中的除水剂和净化材料为无水硫酸镁、psa和c18；每1毫升鱼肉待净化液塑料离心管中需要使用150mg无水硫酸镁，50mg psa和50mg c18进行净化。

31、本发明进一步设置为：所述步骤s3中的lc-ms/ms(液相色谱-质谱/质谱)测定，优化液相条件，包括1.流动相的选择：通过对比2.00ng/ml，5.00ng/ml，10.0ng/ml，20.0ng/ml标准溶液的响应峰面积与拟合方程的r值，发现：克百威与3-羟基克百威各相应浓度在甲醇-5mmol/l甲酸铵(0.1％甲酸)水溶液中响应值更高，峰形更好，各浓度目标化合物在流动相甲醇-5mmol/l甲酸铵(0.1％甲酸)水溶液中离子比也更稳定。因此选择甲醇-5mmol/l甲酸铵(0.1％甲酸)水溶液为流动相；2.流动相比例的选择优化：采用二元以上的混合溶剂为流动相,因混合溶剂的强度随其组成连续变化,即能找到适宜溶剂强度的流动相,而且可保持溶剂的低黏度以降低柱压和提高柱效,同时还可提高分离的选择性。选取5mmol/l甲酸铵(0.1％甲酸)溶液作为流动相的水相部分，比较时间长度为15min与10min两种流动相梯度比例，实验分析发现10min为合适的时间；3.柱温的优化：比较室温、30℃、35℃、40℃、45℃对色谱分离的影响，结果发现对克百威和3-羟基克百威的色谱分离影响不大，但柱温越高，色谱分离的速度越快，因此，为节省色谱分析时间，本发明选择45℃作为液相色谱法中的柱温。在此条件下，克百威出峰时间为5.10min，3-羟基克百威出峰时间为3.81min。

32、优化为：液相色谱使用的色谱柱为c18色谱柱,c18色谱柱为150mm×2.1mm(内径),粒径2.6μm；使用的流动相为a:甲醇、b:5mmol/l甲酸铵-0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.3ml/min；进样量为2μl；柱温为45℃；梯度洗脱程序见下表2，

33、表2梯度洗脱程序

34、 时间/min 流动相a/％ 流动相b/％ 0 20 80 5.0 90 10 8.0 90 10 9.0 20 80 10.0 20 80

35、本发明进一步设置为：所述步骤s3中的lc-ms/ms(液相色谱-质谱/质谱)测定，质谱条件优化：以10μl/min的流速分别连续注射1.0mg/l的克百威和3-羟基克百威标准溶液入esi离子源中，在正离子模式下对克百威和3-羟基克百威进行一级质谱分析(q1扫描)，得到准分子离子峰，优化去簇电压。对准分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息，优化碰撞能，选择响应值高、基线噪音低的离子对作为监测离子对(定性离子对)，选择信号最强的离子对作为定量离子对，此外，对离子源温度、鞘气、辅助气等参数进行优化，采用mrm模式采集数据。

36、优化为质谱测定时电离方式为电喷雾电离(esi)；鞘气为241.32kpa；辅助气为68.95kpa；吹扫气为6.89kpa；离子传输管温度为350℃；蒸发温度为300℃；扫描方式采用扫描正离子；监测方式为多反应监测方式(mrm)；定量离子对、定性离子对、碰撞能量(ev)见下表3，

37、表3定量离子对、定性离子对、碰撞能量(ev)

38、

39、带“*”的离子为定量离子。

40、综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明主要是采用quechers前处理方法。试样用乙腈提取，通过分散固相萃取净化，采用液相色谱-质谱/质谱仪检测，外标法定量。通过本发明，主要解决了现在标准中缺少水产品中克百威和其代谢物3-羟基克百威检测方法的问题，同时quechers前处理方法，简化了样品处理流程，使得操作简便，成本低，耗费溶剂量少，环境友好，能满足大批量样品检测的需求。