检测粉尘螨过敏原的芯片及其制备方法与试剂盒与流程

1.本技术涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测粉尘螨过敏原的芯片及其制备方法与试剂盒。


背景技术：

2.尘螨是诱发哮喘、过敏性鼻炎和湿疹等过敏性疾病的重要致敏原；广泛分布于房屋内阴暗角落、地毯、床垫、枕头、沙发、空调、凉席等，是生活中最常见的过敏原之一。尘螨是属于蚍螨科、尘螨属的一种微型生物，其中与人类过敏性疾病有关的主要包括屋尘螨、粉尘螨和埋内欧螨等。
3.粉尘螨的过敏原组分大多数是生物酶，致敏性极强，容易引物过敏反应。目前，已被发现和命名的粉尘螨过敏原组分有37种；其命名以国际动物分类为依据，属名前三个字母加上种名的首字母、及阿拉伯数字编号，如粉尘螨的第1组分可命名为der f 1。
4.目前，粉尘螨的体内过敏诊断和过敏原特异性免疫治疗主要是依靠天然的粉尘螨提取物。然而，粉尘螨提取物中包含了致敏成分和非致敏成分，可能引起交叉反应而导致诊断不准确；且无法明确对患者致敏的具体过敏原组分；更不能定量地反应过敏原组分的特异性ige水平。


技术实现要素：

5.基于此，有必要提供一种定量地检测粉尘螨过敏原多组分的芯片及其制备方法与试剂盒。
6.根据本技术的一个方面，提供了一种检测粉尘螨过敏原的芯片，所述芯片包括基材，所述基材上设置有检测区，所述检测区包括多个相互独立的检测单元，每个所述检测单元内包被有以下粉尘螨过敏原组分中的一种：der f 1、der f 2、der f 3、der f 4、der f 5、der f 6、der f 7、der f 8、der f 10、der f 11、der f 13、der f 14、der f 15、der f 16、der f 17、der f 18、der f 20、der f 21、der f 22、der f 23、der f 24、der f 25、der f 26、der f 27、der f 28、der f 29、der f 30、der f 31、der f 32、der f 33、der f 34、der f 35、der f 36、der f 37、der f 38、der f 39和der f 40，至少有两个所述检测单元内包被的过敏原组分不同。
7.在其中一个实施例中，所述基材上还具有质控区，所述质控区与所述检测区相互独立，所述质控区包括质控单元，所述质控单元内包被有质控品。
8.在其中一个实施例中，多个所述检测区呈矩阵分布；所述质控区包括阳性质控区和阴性质控区，所述阳性质控区、所述阴性质控区和所述检测区相互独立。
9.在其中一个实施例中，所述检测区包括37个相互独立的检测单元，所述37个相互独立的检测单元上包被的过敏原各不相同。
10.在其中一个实施例中，所述基材选自如下材料中的一种：黑玻璃、聚苯乙烯、酸纤维素或聚偏二氟乙烯。
11.根据本技术的一个方面，还提供了一种检测粉尘螨过敏原组分的试剂盒，包括上述的检测粉尘螨过敏原的芯片。
12.在其中一个实施例中，还包括反应试剂和检测试剂，所述反应试剂包括标记有标记物的第二抗体；所述检测试剂包括鲁米诺、tris和过氧化氢中的一种或多种。
13.根据本技术的一个方面，还提供了一种检测粉尘螨过敏原组分的芯片的制备方法，包括如下步骤：
14.对基材进行预处理，使基材能够与生物大分子偶联；及
15.在预处理后的基材上间隔地点入不同的粉尘螨过敏原组分，所述粉尘螨过敏原组分选自der f 1、der f 2、der f 3、der f 4、der f 5、der f 6、der f 7、der f 8、der f 10、der f 11、der f 13、der f 14、der f 15、der f 16、der f 17、der f 18、der f 20、der f 21、der f 22、der f 23、der f 24、der f 25、der f 26、der f 27、der f 28、der f 29、der f 30、der f 31、der f 32、der f 33、der f 34、der f 35、der f 36、der f 37、der f 38、der f 39和der f 40中的一种；及
16.对点有粉尘螨过敏原组分的基材进行封闭，制得检测粉尘螨过敏原组分的芯片。
17.在其中一个实施例中，所述封闭步骤包括如下步骤：
18.将点样后的基材没入封闭液中1h～4h，取出基材，离心去除残余封闭液，制得所述芯片。
19.在其中一个实施例中，所述封闭液为含有封闭蛋白的缓冲液；
20.和/或，所述封闭液含有牛血清白蛋白或卵清蛋白，所述封闭液含有pbs缓冲液、tris缓冲液、heps缓冲液和mops缓冲液中的一种或多种。
21.与现有技术相比，本技术具有如下有益效果：
22.本技术的粉尘螨过敏原检测芯片，能够同时、定量地检测多种粉尘螨过敏原组分；且仅需取少量患者血清样本与芯片反应，即可实现对37种粉尘螨过敏原组分的定量检测。此外，使用本技术的芯片对粉尘螨过敏患者进行检测，能够帮助医生明确具体的致敏组分及各个组分的ige水平，为过敏患者选择合适的治疗方案提供指导、评估过敏反应的风险。同时，本技术的芯片能够用于监测脱敏治疗患者的进程，及时反映治疗效果。
附图说明
23.图1为本技术的检测粉尘螨过敏原组分的芯片示意图。
24.附图标记说明：
25.101、阳性质控单元；102、检测单元；103、阴性质控单元。
具体实施方式
26.为使本技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本技术。但是本技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本技术内涵的情况下做类似改进，因此本技术不受下面公开的具体实施例的限制。
27.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具
体的实施例的目的，不是旨在于限制本技术。除非另有特别说明，本技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
28.术语“ige”指免疫球蛋白e，是一种介导过敏反应的抗体，在人体内含量较低。
29.如图1所示，本技术提供了一种检测粉尘螨过敏原的芯片，包括设置有检测区的基材，检测区包括多个相互独立的检测单元102，每个独立的检测单元102内包被有以下粉尘螨过敏原组分中的一种：der f 1、der f 2、der f 3、der f 4、der f 5、der f 6、der f 7、der f 8、der f 10、der f 11、der f 13、der f 14、der f 15、der f 16、der f 17、der f 18、der f 20、der f 21、der f 22、der f 23、der f 24、der f 25、der f 26、der f 27、der f 28、der f 29、der f 30、der f 31、der f 32、der f 33、der f 34、der f 35、der f 36、der f 37、der f 38、der f 39和der f 40，至少有两个检测单元102内包被的过敏原组分不同。
30.随着过敏性疾病的过敏原蛋白组分不断被发现，过敏原组分特异性ige检测越来越普遍，即通过纯化的天然提取物或重组过敏原分子来识别对患者致敏的单个组分，从而提高过敏诊断和预后的准确性。
31.在其中一些实施方式中，基材上还包括与检测单元102相互独立的质控区，质控区内包括多个包被有质控品的质控单元。
32.在一些实施例中，如图1所示，上述质控区至少包括阳性质控单元101和阴性质控单元103中的一种。
33.在一些实施例中，上述质控区包括阳性质控单元101和阴性质控单元103，其中，阳性质控单元101、阴性质控单元103和检测单元102相互独立分布。
34.在图示的实施例中，4个相互独立的阳性质控单元101排成1列；4个相互独立的阴性质控单元103排成1列；37个相互独立的检测单元102排成10列，每个检测单元内包被的过敏原各不相同。
35.在图示的实施方式中，各个独立的检测单元102呈矩阵分布。可以理解的是，在其他实施例中，各个独立的检测单元102的分布不限于上述，还可以呈其他形状分布，例如以芯片的中心为圆心的环状分布，又例如随机分布。
36.可以理解的是，在其他实施例中，阳性质控单元101、阴性质控单元103、检测单元102的数量还可以根据实际情况进行调整，例如6个阳性质控单元101，6个阴性质控单元103，30个检测单元102。
37.可以理解的是，阳性质控单元101和阴性质控单元103与检测单元102的排列方式也不限于上述。
38.在其中一些实施方式中，上述基材的材料选自如下材料中的一种：黑玻璃、聚苯乙烯、酸纤维素(nc)或聚偏二氟乙烯(pdvf)。
39.可以理解的是，上述基材的本体及杂质不会溶出而对反应体系产生影响；基材表面平整光滑，非特异性吸附作用较弱，容易清洗，背景低；基材表面浸润作用小，点样后液滴不会润开，集成优势大、且点样所需抗原蛋白的用量少。
40.上述基材的材料具有质地均一、无气泡、表面光滑、无划痕、无油污、无折断、侧边光滑、无毛糙缺损等优点。
41.在一些实施例中，基材可以为片状、或长条状。可以理解的是，在其他实施例中，基
材的形状不限于上述，还可以是其他形状。
42.在一些实施例中，基材还具有1个可以作为基材正反面标识的单边倒角，及2个双边倒角。
43.在一些具体示例中，单边倒角的斜边长为0.8mm～2.0mm，双边倒角的斜边长为0.6mm～1.8mm。
44.在一些实施例中，基材的长度为29.95mm～30.05mm，基材的宽度为3.95mm～4.05mm，基材的厚度为0.75mm～0.85mm。
45.本技术通过在芯片基材上固定多种粉尘螨过敏原组分，检测时能够捕获样本中特异性的抗体，并使之与标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的第二抗体结合，酶能够催化化学发光底物，从而产生化学发光信号。通过ccd(charge coupled device，电荷耦合器件)摄像头采集光信号，根据信号浓度绘制定量曲线，并根据信号的强弱计算样本中过敏原特异性抗体的水平，从而判断患者是否过敏、以及过敏的严重程度。
46.上述芯片具有至少如下优点：
47.(1)样本量少：仅需少量患者血清，就可以同时定量检测多个粉尘螨过敏原，并且还能明确对患者致敏的具体组分。
48.(2)简单便利：结合全自动化的芯片阅读仪，能够快速、大批量地检测多个样本。
49.可以理解的是，上述芯片还可以用于监测过敏患者脱敏治疗过程中各个过敏原组分的水平变化，及时反映疗效。
50.可以理解的是，上述芯片也可以用于评估患者可能出现过敏症状的风险。
51.使用本技术的芯片检测患者对粉尘螨过敏原全组分的特异性ige水平，明确具体的致敏组分及过敏严重程度，能够帮助患者在临床上针对性地选择合适的治疗方案，实现精准治疗。
52.临床上，过敏患者的治疗方法主要包括药物治疗和脱敏治疗(过敏原特异性免疫)。脱敏治疗的原理是明确致使过敏的主要过敏原，让患者反复接触并逐渐增加过敏原提取物的剂量，使机体免疫系统产生对此类过敏原的耐受，从而控制或减轻过敏症状的一种对因治疗方法。
53.在进行脱敏治疗之前，使用本技术的芯片能够明确对不同患者致敏的具体组分，从而选择对应的过敏原提取物，进行脱敏治疗。
54.在过敏患者的脱敏治疗过程中，使用本技术的芯片进行检测，能够随时反映脱敏治疗的效果，实现对治疗过程的监测。
55.本技术还提供了一种检测粉尘螨过敏原组分的试剂盒，包括上述任一实施例的检测粉尘螨过敏原组分的芯片。
56.在其中一些实施方式中，上述试剂盒还包括反应试剂和检测试剂，反应试剂包含标记有标记物的第二抗体；检测试剂中含有鲁米诺、tris和过氧化氢中的一种或多种。
57.在一些实施例中，反应试剂中含有标记有辣根过氧化物酶的第二抗体。
58.在一些实施例中，第二抗体为鼠抗人ige抗体。
59.在一些实施例中，检测试剂包括试剂a和试剂b；其中，试剂a中含有0.8wt％～1.2wt％的鲁米诺和1.5wt％～2.5wt％的tris，试剂b中含有0.8wt％～1.2wt％的过氧化氢。
60.在一些具体示例中，试剂a中含有1.0wt％的鲁米诺和2.0wt％的tris，试剂b中含有1.0wt％的过氧化氢。
61.上述试剂盒能够定量地、同时检测多个粉尘螨过敏原组分，反映待测样本中不同过敏原组分的特异性ige水平；可以用于临床上辅助诊断患者是否过敏并确定具体的过敏成分；还可以用于监测患者的脱敏治疗过程的疗效。
62.本技术还提供了一种检测粉尘螨过敏原组分的芯片的制备方法，具体包括步骤s100～s300：
63.步骤s100：使用氢氧化钠溶液和硅烷溶液分别对基材进行预处理，使基材能够与生物大分子偶联。
64.步骤s200：在预处理后的基材上相互间隔地点入不同的粉尘螨过敏原组分，过敏原组分选自der f 1、der f 2、der f 3、der f 4、der f 5、der f 6、der f 7、der f 8、der f 10、der f 11、der f 13、der f 14、der f 15、der f 16、der f 1 7、der f 18、der f 20、der f 21、der f 22、der f 23、der f 24、der f 25、der f 26、der f 27、der f 28、der f 29、der f 30、der f 31、der f 32、der f 33、der f 34、der f 35、der f 36、der f 37、der f 38、der f 39和der f 40中的一种。
65.步骤s300：将点有过敏原组分的基材进行封闭。
66.在其中一些实施方式中，步骤s100中，基材预处理包括步骤s101～s103。
67.步骤s101：将基材放置在4wt％～6wt％的氢氧化钠溶液中浸泡16h～24h，浸泡后使用纯水冲洗。
68.步骤s102：将基材放置在0.05wt％～1wt％的硅烷溶液中浸泡20min～60min。
69.步骤s103：使用氮气吹扫浸泡后的基材，放入烘箱中100℃～180℃烘烤0.2h～0.6h。
70.在一些实施例中，步骤s101中，氢氧化钠溶液的浓度为4.5wt％～5.5wt％。
71.在一些具体示例中，步骤s101中，氢氧化钠溶液的浓度为5wt％。
72.在一些实施例中，步骤s102中，硅烷溶液的浓度为0.5wt％～1wt％。
73.在其中一些实施方式中，步骤s102中，硅烷溶液的介质为体积百分含量为20％～30％的乙醇。
74.在一些具体示例中，步骤s102中，硅烷溶液的介质为体积百分含量为25％的乙醇。
75.在其中一些实施方式中，步骤s200中，由机器自动化点样，在各个检测单元102分别点入不同的粉尘螨过敏原组分。
76.在其中一些实施方式中，步骤s200中，各个检测单元102的排列方式如图1所示。
77.在其中一些实施方式中，步骤s300中，将点样后的黑玻片置于封闭液中浸泡1h～4h，取出黑玻片，离心去除残余封闭液，制得所述芯片。
78.在其中一些实施方式中，上述封闭液为含有封闭蛋白的缓冲溶液。
79.在其中一些实施方式中，封闭蛋白选自牛血清白蛋白或卵清蛋白，缓冲液选自mops缓冲液、tris缓冲液、heps缓冲液和pbs缓冲液中的一种或多种。
80.上述检测粉尘螨过敏原组分的芯片的制备方法操作简单、耗时短、成本低。
81.具体实施例
82.下面将结合具体实施例和对比例对本技术作进一步说明，但不应将其理解为对本
申请保护范围的限制。
83.实施例1
84.(1)制备芯片：
85.①
预处理：将黑玻片(基材)置于5wt％的氢氧化钠溶液中浸泡16h，之后采用纯水清洗2～8次；将黑玻片置于质量浓度为1wt％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡20min；使用氮气吹扫浸泡后的黑玻片，并放入烘箱中，180℃条件下烘烤0.2h。
86.②
点样：采用机器自动化点样，在黑玻片上形成如图1所示的矩阵；每个检测单元中包被一种过敏原蛋白溶液；所制得的芯片包括37种粉尘螨过敏原组分(der f 1、der f 2、der f 3、der f 4、der f 5、der f 6、der f 7、der f 8、der f 10、der f 11、der f 13、der f 14、der f 15、der f 16、der f 17、der f 18、der f 20、der f 21、der f 22、der f 23、der f 24、der f 25、der f 26、der f 27、der f 28、der f 29、der f 30、der f 31、der f 32、der f 33、der f 34、der f 35、der f 36、der f 37、der f 38、der f 39和der f 40)。
87.③
封闭：将点样后的黑玻片没入封闭液(含3wt％牛血清白蛋白的tris缓冲液)中3h，之后取出黑玻片，离心去除残余封闭液，制得所述芯片。
88.(2)试剂盒：将步骤(1)中制得的芯片与标记有辣根过氧化物酶的第二抗体溶液(鼠抗人ige)、检测试剂a(含有1wt％鲁米诺和2wt％tris)、检测试剂b(1％过氧化氢)共同包装成试剂盒。
89.实施例2
90.(1)制备芯片：
91.①
预处理：将黑玻片置于5wt％氢氧化钠溶液中浸泡24h，之后采用纯水清洗2～8次；将黑玻片置于质量浓度为0.05wt％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡60min；使用氮气吹扫浸泡后的黑玻片，并放入烘箱中，140℃烘烤0.4h。
92.②
点样：如采用机器自动化点样，在黑玻片上形成如图1所示的矩阵；每个检测单元中包被一种过敏原蛋白溶液；所制得的芯片包括37种粉尘螨过敏原组分(der f 1、der f 2、der f 3、der f 4、der f 5、der f 6、der f 7、der f 8、der f 10、der f 11、der f 13、der f 14、der f 15、der f 16、der f 17、der f 18、der f 20、der f 21、der f 22、der f 23、der f 24、der f 25、der f 26、der f 27、der f 28、der f 29、der f 30、der f 31、der f 32、der f 33、der f 34、der f 35、der f 36、der f 37、der f 38、der f 39和der f 40)。
93.③
封闭：将点样后的黑玻片没入封闭液(含6wt％卵清蛋白的pbs缓冲液)中4h，之后取出黑玻片，离心去除残余封闭液，制得所述芯片。
94.(2)试剂盒：将步骤(1)中制得的芯片与标记有辣根过氧化物酶的第二抗体溶液(鼠抗人ige)、检测液a(含有1wt％鲁米诺和2wt％tris)、检测b(1％过氧化氢)共同包装成试剂盒。
95.实施例3
96.(1)制备芯片：
97.①
预处理：将黑玻片置于5wt％氢氧化钠溶液中浸泡20h，之后采用纯水清洗2～8次；将黑玻片置于质量浓度为0.05wt％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡30min；使用氮
气吹扫浸泡后的黑玻片，并放入烘箱中，100℃烘烤0.6h。
98.②
点样：采用机器自动化点样，在黑玻片上形成如图1所示的矩阵；每个检测单元中包被一种过敏原蛋白溶液；所制得的芯片包括37种粉尘螨过敏原组分(der f 1、der f 2、der f 3、der f 4、der f 5、der f 6、der f 7、der f 8、der f 10、der f 11、der f 13、der f 14、der f 15、der f 16、der f 17、der f 18、der f 20、der f 21、der f 22、der f 23、der f 24、der f 25、der f 26、der f 27、der f 28、der f 29、der f 30、der f 31、der f 32、der f 33、der f 34、der f 35、der f 36、der f 37、der f 38、der f 39和der f 40)。
99.③
封闭：将点样后的黑玻片没入封闭液(含4wt％牛血清白蛋白的mops缓冲液)中1h，之后取出黑玻片，离心去除残余封闭液，制得所述芯片。
100.(2)试剂盒：将步骤(1)中制得的芯片与标记有辣根过氧化物酶的第二抗体溶液(鼠抗人ige)、检测液a(含有1wt％鲁米诺和2wt％tris)、检测b(1％过氧化氢)共同包装成试剂盒。
101.实施例4
102.使用实施例1所制备的芯片对4份过敏患者的血清样本进行粉尘螨过敏原组分检测；配合江苏三联生物工程股份有限公司生产制造的全自动化芯片阅读仪进行自动化检测。
103.(1)待测血清样本分别与芯片反应，使芯片上固定的37种粉尘螨过敏原组分与样品中潜在的抗体结合。
104.(2)将芯片转移到预加了辣根过氧化物酶第二抗体溶液的反应杯中，进一步反应形成抗原-抗体复合物，反应结束后洗涤芯片并检测反应信号。
105.(3)将芯片转移到预加了发光底物的反应杯中，利用制冷ccd对芯片反应区进行成像，读取点阵灰度值。
106.(4)以不同浓度的校准品作为样本进行检测，作出灰度-浓度定量曲线，通过该标准曲线计算血清样本中不同指标的相应水平。
107.本实施例中4个待测样本的检测结果如表1所示。
108.表1待测样本的粉尘螨过敏原组分水平的检测结果
109.110.[0111][0112]
由上表可知，本技术的芯片能够同时对待测样本中37种粉尘螨过敏原特异性ige的水平进行定量检测，特异性地检出对患者致敏的过敏原组分。同时，本技术的芯片检测粉尘螨过敏原的结果与phadia immunocap的检测结果相比，阳性检出率一致，准确性高。
[0113]
本技术的芯片与全自动芯片阅读仪相配合进行检测，具有简单、快速等特点，适用于临床上对大批量样本进行检测；此外，定量地检测各个过敏原抗体浓度，能够为过敏原患者治疗提供参考，选择针对性的治疗方法；且能够随时反映脱敏治疗的效果，对脱敏治疗患者的治疗进程进行有效监测。
[0114]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0115]
以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。