肾炎康复片HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱与流程

肾炎康复片hplc指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱
技术领域
1.本发明属于药物检测技术领域，尤其是涉及肾炎康复片hplc指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。


背景技术：

2.天津同仁堂集团股份有限公司重点产品肾炎康复片来源于著名中医专家赵恩俭多年治疗慢性肾炎疾病临床经验之精华，收录于《中华人民共和国药典》2020年版一部。
3.该药由西洋参、人参、地黄、盐杜仲、山药、白花蛇舌草、黑豆、土茯苓、益母草、丹参、泽泻、白茅根、桔梗十三味中药组成，具有益气养阴，补肾健脾，清解余毒的功效，用于气阴两虚，脾肾不足，水湿内停所致的水肿，症见神疲乏力，腰酸腿软，面目、四肢浮肿，头晕耳鸣；慢性肾炎、蛋白尿、血尿见上述症候者。
4.中药制剂包含很多化学成分。这些化学组分产生整体的治疗效果，是重要评价的主要指标。单一的成分，并不能够真正反映出中药制剂品质的实际水平。中国药典2020版只对丹参中的丹参中丹参酮ⅱa、益母草中的盐酸水苏碱、桔梗薄层人参和西洋参中rb1、re、rg、拟f11薄层鉴别和丹参中丹参酮ⅱa含量，但由于肾炎康复片药物组成众多，仅仅检测这5种药材难以全面、准确反映改制剂的疗效和整体质量。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明旨在提出肾炎康复片hplc指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，以全面的反映肾炎康复片的特性，具有良好的专属性，有助于控制肾炎康复片的质量，确保临床疗效。
6.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
7.肾炎康复片hplc指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
8.s1、供试样品溶液的制备：取肾炎康复片去除包衣，粉碎，加入甲醇，水浴回流，过滤，得到供试样品溶液；
9.s2、对照品溶液的制备：分别称取定丹参酮ⅱa、人参皂苷rb1、盐酸益母草碱、丹酚酸b、落新妇苷、大豆苷、松脂醇二葡萄糖苷、对香豆酸、迷迭香酸对照品，加入甲醇，制得对照品溶液；
10.s3、指纹图谱的建立：分别吸取供试样品溶液及对照品溶液注入液相色谱仪进行测定，即得供试样品的指纹图谱；
11.s4、标准指纹图谱的确认：按照上述方法分别对多批次肾炎康复片建立指纹图谱，将多批次肾炎康复片的指纹图谱导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱评价系统”2012版软件中，生成标准指纹图谱，所述标准指纹图谱具有20个共有峰。
12.进一步地，述对照品溶液中定丹参酮ⅱa、人参皂苷rb1、盐酸益母草碱、丹酚酸b、落新妇苷、大豆苷、松脂醇二葡萄糖苷、对香豆酸、迷迭香酸的浓度为2-30μg/ml；优选地，对照品溶液中丹参酮ⅱa浓度为8μg/ml、人参皂苷rb1浓度为20μg/ml、盐酸益母草碱浓度为5μ
g/ml、丹酚酸b浓度为5μg/ml、落新妇苷浓度为5μg/ml、大豆苷浓度为10μg/ml、松脂醇二葡萄糖苷浓度为20μg/ml、对香豆酸浓度为5μg/ml、迷迭香酸浓度为10μg/ml。
13.进一步地，步骤s3中的测定条件为：色谱柱：agilent technologies zorbax sb-c18；4.6
×
250mm，3.5μm，流速：0.6ml/min，流动相：其中a：0.1-0.2％磷酸溶液,b：乙腈，柱温：20℃-35℃，进样体积6μl，分析时间：188min，扫描波长：203-360nm。
14.进一步地，0-10min，a：b体积比98:2；10-18min，a：b体积比98:2-87:13；18-58min，a：b体积比87:13-86:14；58-68min，a：b体积比86:14-83:17；68-88min，a：b体积比83:17-80:20；88-123min，a：b体积比80:20-79:21；123-155min，a：b体积比79:21-49:51；155-165min，a：b体积比49:51-19:81；165-188min，a：b体积比19:81-9:91。
15.进一步地，0-37.5min，扫描波长为360nm；37.5-52.5min，扫描波长改为203nm；52.5-71min，扫描波长改为330nm；71-83min，扫描波长改为270nm；83-110min，扫描波长改为210nm；110-143min，扫描波长改为275nm；143-146.5min，扫描波长改为203nm；146.5-183min，扫描波长改为275nm；183-188min，扫描波长改为203nm。
16.进一步地，0-55min柱温：20℃，55-188min柱温：35℃。
17.进一步地，还包括以下步骤：
18.根据肾炎康复片处方制备单味药材溶液及单味或多味药材阴性对照处方样品溶液，吸取单味药材溶液、单味或多味药材阴性对照处方样品溶液及步骤s2中的对照品溶液注入液相色谱仪进行测定，建立单味药材溶液及单味或多味药材阴性对照处方样品溶液的指纹图谱，并与20个共有峰进行比较，确定指纹峰归属。
19.进一步地，指纹峰1、3、7、9、10、11、12来自土茯苓，指纹峰2来自盐杜仲，指纹峰4、8来自黑豆，指纹峰5来自益母草，指纹峰6来自白花蛇舌草和白茅根，指纹峰13、14、15、17、18、19、20来自丹参，指纹峰16来自人参和西洋参。
20.根据上述任一所述的建立方法建立的标准指纹图谱，各共有峰的相对保留时间为：1号峰0.329
±
0.020、2号峰0.357
±
0.020、3号峰0.361
±
0.020、4号峰0.395
±
0.020、5号峰0.409
±
0.020、6号峰0.460
±
0.020、7号峰0.615
±
0.020、8号峰0.637
±
0.010、9号峰0.643
±
0.010、10号峰0.709
±
0.010、11号峰0.727
±
0.010、12号峰0.750
±
0.010、13号峰0.817
±
0.010、14号峰0.873
±
0.010、15号峰1.000、16号峰1.216
±
0.010、17号峰1.401
±
0.020、18号峰1.439
±
0.020、19号峰1.476
±
0.020、20号峰1.540
±
0.020，其中，15号峰为s峰；优选地，2号峰为松脂醇二葡萄糖苷，4号峰为大豆苷，5号峰为盐酸益母草碱，6号峰为对香豆酸，9号峰为落新妇苷，14号峰为迷迭香酸，15号峰为丹酚酸b，17号峰为人参皂苷rb1，19号峰为丹参酮ⅱa。
21.如上任一所述的肾炎康复片hplc指纹图谱的建立方法或如上所述的标准指纹图谱在肾炎康复片检测领域的应用。
22.进一步地，所述应用的方法为：将肾炎康复片样品按照步骤s1-s3获得样品的指纹图谱，以标准指纹图谱作为对照，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱评价系统”2012版软件，进行指纹图谱相似度计算，以相似度不低于0.90为标准判断样品是否合格。
23.相对于现有技术，本发明所述的肾炎康复片hplc指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱具有以下优势：
24.(1)本发明所述的肾炎康复片hplc指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱能够全
面的反映肾炎康复片的特性，具有良好的专属性，为保证用药安全、稳定和质量可控提供参考依据，可实现对肾炎康复片制剂的质量监控，有效的控制了肾炎康复片的质量，保证了药物的疗效，促进中医药的继承和发展。
25.(2)本发明所述的肾炎康复片hplc指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱能够对国内已上市的肾炎康复片产品进行检测并评价，用以控制肾炎康复片市售制剂的质量，区分肾炎康复片市售制剂的来源，确保肾炎康复片市售制剂的临床疗效。
附图说明
26.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
27.图1为本发明实施例2所述的10批次肾炎康复片的供试样品溶液的指纹图谱及肾炎康复片标准指纹图谱示意图，其中r(20)为肾炎康复片标准指纹图谱,s1(20)-s10(20)分别为10批肾炎康复片供试样品溶液的指纹图谱；
28.图2为本发明实施例2所述的混合对照品溶液的指纹图谱示意图；
29.图3为本发明实施例2所述的肾炎康复片标准指纹图谱示意图；
30.图4为本发明实施例3所述的药材阴性对照处方样品溶液的指纹图谱示意图；
31.图5为本发明实施例4所述的不同流动相溶剂对hplc色谱图影响的对比示意图；
32.图6为本发明实施例4所述的不同浓度磷酸对hplc色谱图影响的对比示意图；
33.图7为本发明实施例5所述的不同柱温对hplc色谱图影响的对比示意图。
具体实施方式
34.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
35.下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
36.各实施例中使用的原料及仪器如下：
37.试剂：乙腈(美国fisher公司，色谱纯)；磷酸(美国fisher公司，hplc grade，85％)；甲醇(美国fisher公司，色谱纯)；纯化水(杭州娃哈哈集团有限公司)；
38.对照品：丹参酮ⅱa(批号：110766-202022)、丹酚酸b(批号：111562-201917)、盐酸益母草碱(批号：111823-201704)、落新妇苷(批号：111798-201805)、大豆苷(批号：111738-201603)、杜脂醇二葡萄糖苷(批号：111537-201706)、人参rb1(批号：110704-202129)、迷迭香酸(批号：111871-201706)以上对照品来源：中国食品药品检测研究院；对香豆酸(批号：240072-201912来源：上海鸿永生物科技有限公司)；
39.药材：西洋参(批号：1103z2101001，产地：吉林)、人参(批号：1234z2103002，产地：吉林)、地黄(批号：1095z2102001，产地：河南)、盐杜仲(批号：1073z2101002，产地：四川)、山药(批号：1083z2101001，产地：河南)、白花蛇舌草(批号：1215z2101001，产地：河南)、黑豆(批号：1141z2101001，产地：河北)、土茯苓(批号：1223z2101001,产地：广西)、益母草(批号：1158z2101001，产地：河北)、丹参(批号：1088z2102001，产地：山东)、泽泻(批号：1075z2105001，产地：四川)、白茅根(批号：1097z2101001,产地：河北)、桔梗(批号：1050z2102001,产地：广西)，市售药材，由天津同仁堂集团股份有限公司质量部检验合格；
40.供试品：由天津同仁堂集团合格股份有限公司提供共10批次肾炎康复片，批号如表1所示。
41.表1肾炎康复片批号
42.编号批号编号批号s1cp17055s6cp17060s2cp17056s7cp17061s3cp17057s8cp17062s4cp17058s9cp17063s5cp17059s10cp17064
43.仪器
44.安捷伦1260高效液相色谱仪(工作站：openlab cds2.1,及openlabc.01.07,g1311c四元泵，g 1329b自动进样器，g1316a柱温箱，g1315d dad检测器)，al204和xs205(梅特勒-托利多mettler toledo仪器上海有限公司)分析电子天平
45.实施例1
46.本实施例分别测定上述供试样品溶液和对照品溶液获得供试样品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱。二者指纹图谱进行比较，根据对照品溶液指纹图谱中的已知特征峰，通过保留时间指认出供试样品溶液中指纹图谱的相应特征峰，从而对供试样品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位，获得肾炎康复片指纹图谱，具体包括以下步骤：
47.供试样品溶液的制备：取肾炎康复片去除包衣，粉碎，取1.0克加入甲醇20ml，水浴回流2小时，取出放凉至室温，过滤，取滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得；
48.混合对照品溶液的制备：精密称定丹参酮ⅱa、人参皂苷rb1、盐酸益母草碱、丹酚酸b、落新妇苷、大豆苷、松脂醇二葡萄糖苷、对香豆酸、迷迭香酸对照品适量，加甲醇制成混合对照品溶液，其中，丹参酮ⅱa浓度为8μg/ml、人参皂苷rb1浓度为20μg/ml、盐酸益母草碱浓度为5μg/ml、丹酚酸b浓度为5μg/ml、落新妇苷浓度为5μg/ml、大豆苷浓度为10μg/ml、松脂醇二葡萄糖苷浓度为20μg/ml、对香豆酸浓度为5μg/ml、迷迭香酸浓度为10μg/ml；
49.采用相同的高效液相色谱法，分别精密吸取供试样品溶液、混合对照品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，分别得到供试样品溶液和混合对照品溶液的液相指纹色谱。高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：agilent technologies zorbax sb-c18；4.6
×
250mm，3.5μm；
50.流速：0.6ml/min；
51.流动相：其中a：0.1-0.2％磷酸溶液,b：乙腈，
52.0-10min，a：b体积比98:2；
53.10-18min，a：b体积比98:2-87:13；
54.18-58min，a：b体积比87:13-86:14；
55.58-68min，a：b体积比86:14-83:17；
56.68-88min，a：b体积比83:17-80:20；
57.88-123min，a：b体积比80:20-79:21；
58.123-155min，a：b体积比79:21-49:51；
59.155-165min，a：b体积比49:51-19:81；
60.165-188min，a：b体积比19:81-9:91，
61.柱温：0-55min柱温：20℃；
62.55-188min柱温：35℃，
63.进样体积6μl，
64.分析时间：188min。
65.对肾炎康复片进行200-400nm全紫外波长扫描，以指标成分的药典要求波长结合全波长扫描结果中指标成分的最大吸收，对各指标成分的波长进行确定。其中，松杜脂醇二葡萄糖苷药典检测波长277nm；大豆苷药典检测波长248nm；盐酸益母草碱的药典检测波长277nm。因为这三种成分有效保留时间接近，而且特征峰吸收面积响应值较小，导致与其他成分的出峰响应差别较大，发现其在203nm这三种成分均有较大吸收，故作为共用检测波长。对香豆酸检测波长315nm有最大吸收，但考虑消除其它成分吸收峰干扰，选择330nm作为检测波长。落新妇苷的药典检测波长291nm，但是由于落新妇苷单个指标成分在肾炎康复片中的特征峰吸收面积大，导致与其他成分的出峰响应差别较大，不利于肾炎康复片指纹图谱分析，故选择波长270nm作为落新妇苷检测波长。迷迭香酸检测波长330nm有最大吸收，考虑到迷迭香酸吸收峰附近的特征峰吸面积响应值较小，为避免与其他成分的出峰响应差别较大，故选择210nm作为检测波长。丹酚酸b的药典检测波长286nm，但是由于丹酚酸b单个指标成分在肾炎康复片中的特征峰吸收面积大，导致与其他成分的出峰响应差别较大，不利于肾炎康复片指纹图谱分析，故选择波长275nm作为丹酚酸b检测波长。人参皂苷rb1的药典检测波长203nm，故选择203nm作为检测波长。丹参酮ⅱa的药典检测波长275nm，选择275nm作为检测波长。其中对香豆酸在专属性考察中发现对香豆酸在白花蛇舌草及白茅根中均有，人参皂苷rb1在专属性考察中发现人参、西洋参均有。肾炎康复片中各成分液相色谱行为差异较大，无法在保证各有效成分出峰都有较大反应值的情况下固定检测波长，综合考虑各成分的检测情况，本实施例以程序波长作为检测波长，方保证各有效成分及其它特征峰的小峰与大峰均有合适的检测效果。
66.扫描波长：0-37.5min，扫描波长为360nm；
67.37.5-52.5min，扫描波长改为203nm；
68.52.5-71min，扫描波长改为330nm；
69.71-83min，扫描波长改为270nm；
70.83-110min，扫描波长改为210nm；
71.110-143min，扫描波长改为275nm；
72.143-146.5min，扫描波长改为203nm；
73.146.5-183min，扫描波长改为275nm；
74.183-188min，扫描波长改为203nm。
75.将所述供试样品溶液的指纹图谱与混合对照品溶液的指纹图谱行比较，根据对照品溶液的指纹图谱中已知特征峰通过相对保留时间，指认出供试样品溶液的指纹图谱中的相应特征峰，从而对供试样品溶液指纹图谱中的指标成分进行归属定位，获得肾炎康复片指纹图谱。
76.实施例2
77.本实施例采用实施例1中建立的肾炎康复片指纹图谱的建立方法对10批次肾炎康
复片进行检测，获得供试样品溶液的指纹图谱和混合对照品溶液的指纹图谱，10批次肾炎康复片的批号见表1，得到不同批次的供试样品溶液的指纹图谱，混合对照品溶液的指纹图谱如图2所示，将得到的供试样品溶液的指纹图谱导入国家药典委员会发布的《中药色谱图谱相似度评价系统》2012版软件中，并以表1中s6样品为参照图谱，采用多点校正后自动匹配，平均数生成肾炎康复片标准指纹图谱，10批叠加图谱如图1所示，得到的肾炎康复片标准指纹图谱如图3所示。共标定肾炎康复片的标准指纹图谱包括20个共有峰，占总峰面积的86％以上，其中15号峰出峰时间较为稳定适中，故选15号峰为定位峰s峰。
78.通过10批次肾炎康复片获得的指纹图谱计算，各色谱峰保留时间与同一图谱中s峰的保留时间的比值，得到相对保留时间。见表2。由表2可知，相对保留时间rsd《1％。将10批供试样品溶液的指纹图谱与标准指纹图谱进行相似度对比，结果如表3所示，由表3可知10批样品相似度≥0.90，说明10批次肾炎康复片样品的成分比较稳定，表明该指纹图谱具有代表性。
79.表2 10批供试样品溶液的各色谱峰平均相对保留时间
80.[0081][0082]
表3 10批供试样品溶液的指纹图谱与标准指纹图谱相似度对比
[0083][0084]
将上述的肾炎康复片的标准指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱比较，根据对照品溶液指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出肾炎康复片的标准指纹图谱中的相应特征峰，定位确定所述2号峰为松脂醇二葡萄糖苷、4号峰：大豆苷、5号峰：盐酸益母草碱、6号峰：对香豆酸、9号峰：落新妇苷、13号峰：迷迭香酸、15号峰：丹酚酸b、16号峰：人参rb1、19号峰：丹参酮ⅱa。
[0085]
实施例3
[0086]
肾炎康复片多味药材指纹图谱的筛选方法的过程如下：
[0087]
单味药材溶液的制备：分别称取单味药材粉末1.0g，于50ml三角瓶中，加入甲醇20ml，水浴回流2小时，取出放凉至室温，过滤，取滤液过0.22μm孔径微孔滤膜，即得单味药材供试品溶液；
[0088]
药材阴性对照处方样品溶液：按处方比例，依据肾炎康复片制法自制不含任意一种或多种药材的阴性对照处方供试品。取药材阴性对照处方供试品，研磨成粉，称取粉末1.0g，于50ml三角瓶中，加入甲醇20ml，水浴回流2小时，取出放凉至室温，过滤，取滤液过0.22μm孔径微孔滤膜，即得药材阴性对照处方样品溶液；
[0089]
单味药材溶液、药材阴性样品指纹图谱取得：采用与实施例1中肾炎康复片指纹图谱的检测方法中相同色谱条件的高效液相色谱法测定，从而获得单味药材溶液、药材阴性对照处方样品的指纹图谱；
[0090]
混合对照品溶液指纹图谱取得：采用与实施例1中肾炎康复片指纹图谱的检测方法相同的步骤，得到对照品溶液的指纹图谱；
[0091]
肾炎康复片指纹图谱测定：采用与实施例1中肾炎康复片指纹图谱的检测方法测定，获得肾炎康复片指纹图谱；
[0092]
标准指纹图谱的生成：采用与实施例2中肾炎康复片指纹图谱的检测方法相同的步骤得到肾炎康复片的指纹标准指纹图谱；
[0093]
质量检测：对照品溶液指纹图谱、单味药材溶液的指纹图谱、药材阴性对照处方样品溶液指纹图谱与肾炎康复片的标准指纹图谱进行比较，指认出对照品溶液、单味药材样品溶液在肾炎康复片的标准图谱中的相应特征峰，利用药材阴性对照处方样品溶液对比，排除非特征峰，从而对供试品溶液的指纹图谱中的特征峰进行归属定位；
[0094]
特征峰归属定位技术手段：依据上述肾炎康复片指纹图谱质量检测，通过特征峰相对保留时间及特征峰dad-uv(二极管阵列紫外吸收光谱，范围：200-400nm)光谱指认方法，从而对供试品溶液的标准指纹图谱中的特征峰进行归属定位。
[0095]
结果如图4所示，其中，1为肾炎康复片供试品指纹图谱；2为杜仲阴性对照处方样品指纹图谱；3为黑豆阴性对照处方样品指纹图谱；4为丹参阴性对照处方样品指纹图谱；5为人参阴性对照处方样品指纹图谱；6为西洋参阴性对照处方样品指纹图谱；7为人参-西洋参双阴性对照处方样品指纹图谱；8为土茯苓对照处方样品指纹图谱；9为白花蛇舌草阴性对照处方样品指纹图谱；10为白茅根阴性对照处方样品指纹图谱；11为白花蛇舌草-白茅根双阴性对照处方样品指纹图谱；12为桔梗阴性对照处方样品指纹图谱；13为山药阴性对照处方样品指纹图谱；14为益母草阴性对照处方样品指纹图谱；15为泽泻阴性对照处方样品指纹图谱；16为地黄阴性对照处方样品指纹图谱，将肾炎康复片供试品指纹图谱与各药材溶液、各药材阴性对照处方样品溶液的指纹图谱对照，确定1、3、7、9、10、11、12号峰来源于土茯苓；2号峰来源于盐杜仲；4号峰来源于黑豆；5、8号峰来源于益母草；6号峰来源于白花蛇舌草与白茅根；13、14、15、17、18、19、20号峰来源于丹参；16号峰来源于人参与西洋参。
[0096]
实施例4
[0097]
对本发明中的肾炎康复片指纹图谱的检测方法流动相溶剂选择进行考察。
[0098]
1.溶剂系统考察
[0099]
肾炎康复片供试样品溶液在同等条件下，对磷酸水溶液-乙腈及磷酸水溶液-甲醇流动相系统高效液相色谱法(hplc)色谱图对比分析，乙腈梯度洗脱时基线平稳、漂移小、峰形效果好，故选择磷酸水溶液-乙腈为流动相，如图5所示。
[0100]
2.不同浓度磷酸考察
[0101]
按照上述实施例1中肾炎康复片指纹图谱的检测方法进行检验，肾炎康复片供试样品溶液在0.1％磷酸-乙腈、0.15％磷酸-乙腈、0.2％磷酸-乙腈流动相条件下，hplc色谱图对比分析，0.15％磷酸-乙腈分离度，峰形效果较好，如图6所示。
[0102]
实施例5
[0103]
对本发明中的肾炎康复片指纹图谱的检测方法柱温选择进行考察。
[0104]
按照上述实施例1中肾炎康复片指纹图谱的检测方法进行检验，柱温分别设为20度、30度、35度及柱温梯度(0-55分钟，柱温：20℃；55-188分钟，柱温：35℃)。如图7所示，在前80分钟20度柱温效果在分离度、峰数量好于30度及35度，80分钟以后35度柱温在基线、出峰时间、分离度优于20度及30度柱温，综合考虑确定柱温梯度(0-55分钟，柱温：20℃；55-188分钟，柱温：35℃)为最优。
[0105]
实施例6
[0106]
对本发明中的肾炎康复片指纹图谱的检测方法进行方法学验证，其检测方法及性能指标结果如下：
[0107]
1.精密度：取编号s4(批号：cp17058)的肾炎康复片一份，按照上述实施例1中肾炎康复片指纹图谱的检测方法进行检验，连续进样6次。以15号峰为参照峰s计算，考察指纹图谱中各主要色谱峰保留时间一致性，结果如表4所示，20个共有峰相对保留时间，rsd％≤2.0％。结果表明，方法精密度良好。
[0108]
表4精密度结果
[0109][0110][0111]
2.重复性：取编号s4(批号：cp17058)的肾炎康复片样品六份，按照上述实施例1中肾炎康复片指纹图谱的检测方法进行检验，以15号峰为参照峰s计算，考察指纹图谱中各主要色谱峰保留时间，结果如表5所示，20共有峰相对保留时间，rsd％≤2.0％。结果表明，本发明中方法的重复性好，准确度较高。
[0112]
表5重复性结果
[0113][0114][0115]
3.稳定性：取编号s4(批号：cp17058)的肾炎康复片样品1份，按照上述实施例1中肾炎康复片指纹图谱的检测方法进行检验，制备肾炎康复片制备供试品溶液后分别放置0h，5h，10h，15h，20h，25h进行检测，以15号峰为参照峰s计算，考察指纹图谱中各主要色谱峰保留时间。结果如表6所示，20个共有峰相对保留时间，rsd％≤2.0％。结果表明肾炎康复片在25小时内检测，稳定性良好。
[0116]
表6稳定性结果
[0117][0118]