用于唾液检测的样品垫处理液及其应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于唾液检测的样品垫处理液及其应用，也涉及用样品垫处理液制备的样品垫和用于检测唾液bar原药的试纸条，还涉及样品垫及试纸条的制备方法。


背景技术：

2.胶体金免疫层析试纸条(下面简称试纸条)是指，以胶体金为显色媒介，利用免疫学中抗原抗体能够特异性结合原理，在成型过程中完成这一反应，从而达到检测的目的。试纸条由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜(nc膜)和吸水垫组成，各部分衔接粘贴在pvc底板上。样品垫是试纸条的重要组成部分，样品垫在使用前一般需要经过样品垫处理液进行处理，未经处理的样品垫应用于检测时，会存在较大的问题，比如出现假阳性或假阴性反应。样品垫的主要作用是使检测样本均匀分布在结合垫上，控制样本的液流速度，可与接受多种液体样品，比如尿液、血液、唾液等，其中，相比于尿液血液等来源的样本，唾液有其优点，采用试纸条检测唾液中特定成分的做法越来越多。
3.但是，一般来说，唾液直接滴加在样品垫上，其液流速度是很慢的，而且唾液中其他成分也会影响测试结果，因此滴加在样品垫上的一般是处理后的唾液稀释液，即，在测试唾液中的特定成分时，需要先对唾液进行预处理，比如中国专利cn2007100318103检测唾液中滥用毒品的多联免疫层析试纸条、系统及其制备方法中就提及在检测前需要使用唾液预处理试剂来处理唾液，比如中国专利cn2012100546670口腔螺旋杆菌感染检测方法及用于检测的唾液试板中也提及下需要先将唾液与缓冲液混合均匀后再取样进行检测。显然这种针对唾液的测试方式除了需要试纸条外，还需要对唾液进行预处理的设备和试剂，使用非常不便，步骤复杂而且需要耗费较多时间。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于唾液检测的样品垫处理液及其应用，本发明的样品垫可直接与唾液样品接触，将唾液样品中的干扰物质除去，提高层析效率，本发明的试纸条可直接用于唾液检测bar原药的项目，具有操作方便，准确性高的优点。
5.为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案如下：
6.在本发明的第一方面，本发明提供了一种用于唾液检测的样品垫处理液，包括ph为8的tris-hcl缓冲液、中性的无机钠盐、s9表面活性剂、螯合剂和bsa(牛血清白蛋白)。
7.不同尿液的ph差异较大，缓冲液体系能够稳定层析过程的ph。表面活性剂可提高液体的润湿能力，溶液在低能固体表面(nc膜、玻纤)不能铺展，为改善体系的润湿性质，使溶液能够充分润湿固体的表面。bsa用于封闭样品垫活性位点的惰性蛋白。
8.唾液是一种消化液，其中绝大部分是水，同时还有黏蛋白和淀粉酶等，在层析过程中过多的蛋白质会干扰待测物的有效结合，因此需要在样品垫端尽可能把唾液中多余的蛋
白析出。另外，由于黏蛋白的存在，唾液在样品垫上的液流速度较慢，需要有效将黏蛋白除去，以提高唾液在样品垫的液流速度，本发明采用无机钠盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，从而提高唾液的液流速度。在唾液中还含有钾、钙、氯和硫氰离子等多种微量无机物，其中金属元素会改变胶体金垫内结合过程的离子环境，本发明采用螯合剂将金属离子除去。
9.优选的，以100ml的浓度为200mm的tris-hcl缓冲液为基准，无机钠盐的添加量大于5g，s9表面活性剂的添加量是1.5～2g，螯合剂的添加量是0.8～1g，bsa的添加量是1～2g。更优选的，无机钠盐的添加量是10～25g。
10.优选的，所述无机钠盐是氯化钠。
11.在本发明中，无机钠盐起到促使蛋白质析出的作用，另外，无机钠盐可以与唾液中的水分发生水合作用，有加快唾液与样品垫接触的效果，随着唾液不断与样品垫液接触，唾液中蛋白质持续减少，唾液与样品垫接触速度更快，宏观上表现为提高唾液在样品垫上的液流速度。
12.优选的，所述螯合剂是四苯硼酸钠和/或草酸钠，更优选的，所述螯合剂是四苯硼酸钠。
13.在本发明的第二方面，本发明提供了一种用于唾液检测的样品垫处理液的应用，使用上述样品垫处理液喷涂在玻璃纤维制成样品垫。
14.在本发明的第三方面，本发明也提供了上述样品垫的制备方法，具体步骤如下：
15.s1、将ph为8的tris-hcl缓冲液、无机钠盐、s9表面活性剂、螯合剂和bsa混合制得样品垫处理液；
16.s2、将样品垫处理液均匀喷涂于玻璃纤维上，控制喷涂量为8～10μl/cm，宽度为1.5～2cm，喷涂线条数为3条；
17.s3、完成喷涂后在50～60℃下干燥18～24小时，制得样品垫待用。
18.在本发明的第四方面，本发明提供了一种用于检测唾液bar原药的试纸条，包括底板及设置于底板上依次搭接的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫是由样品垫处理液喷涂在玻璃纤维上形成；
19.其中，胶体金垫上喷涂有胶体金标记羊抗鼠igg抗体及胶体金标记bar抗体，所述硝酸纤维素膜上设有包被bar抗原的t检测线和包被鼠抗人igg抗体的c控制线。
20.优选的，所述胶体金标记羊抗鼠抗体的浓度为20μg/ml，所述胶体金标记bar抗体的浓度为20μg/ml。
21.优选的，制备胶体金垫的步骤如下：
22.制备浓度为5％的胶体金标记羊抗鼠igg抗体及浓度为20％的胶体金标记bar抗体的复溶混合溶液(20mm pbs+0.1％tw-20)，将复溶混合溶液均匀喷涂在玻璃纤维上，喷涂量为2～2.25μg/cm，宽度为1～1.5cm，喷涂线条数为1条，在37℃烘干18～24小时，制得胶体金垫待用。
23.优选的，所述bar抗原的包被浓度为0.3mg/ml，所述鼠抗人igg抗体的包被浓度为0.6mg/ml。
24.优选的，制备硝酸纤维素膜的步骤如下：
25.制备包被浓度为0.3mg/ml的bar抗原的包被溶液(20mm pbs+0.02％bsa)，并喷涂
在硝酸纤维素膜上形成t检测线；制备包被浓度为0.6mg/ml的鼠抗人igg抗体的包被溶液，并喷涂在硝酸纤维素膜上形成c控制线，将完成喷涂后的硝酸纤维素膜置于50℃烘干18～24小时。
26.有益效果：
27.本发明的样品垫处理液通过螯合剂和中性的无机钠盐将唾液中的干扰物质除去，而且通过高浓度的无机钠盐提高唾液的液流速度，提高了层析效率，采用本发明样品垫处理液制作的样品垫可直接加入唾液样本，与现有的检测唾液特定成分的免疫层析法比较，节约了唾液的预处理步骤，降低了唾液检测的步骤和难度，采用本发明样品垫制作的用于检测唾液中bar原药的试纸条，可以做到当面取样当面检测，解决了检测血液或尿液时存在的安全性、隐私性及真实性的问题。
具体实施方式
28.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将说明本发明的具体实施方式。显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他实施方式。
29.本发明提供了一种样品垫处理液及样品垫，该样品垫可以直接接受唾液样本，在毛细管作用下，唾液向前流动，在此过程中，样品垫对唾液中的杂质进行处理，同时提高唾液在样品垫上的液流速度，具体地，样品垫处理液包括ph为8的tris-hcl缓冲液、中性的无机钠盐、s9表面活性剂、螯合剂和bsa，更进一步地，相对于每100ml的浓度为200mm的tris-hcl缓冲液，无机盐的添加量大于5g，s9表面活性剂的添加量是1.5～2g，螯合剂的添加量是0.8～1g，bsa的添加量是1～2g。优选的，对于每100ml的浓度为200mm的tris-hcl缓冲液，无机盐的添加量10～25g，s9表面活性剂的添加量是1.5g，螯合剂的添加量是0.85g，bsa的添加量是1g。
30.样品垫使用上述样品垫处理液喷涂在玻璃纤维制成，具体地，样品垫的制备步骤如下：
31.s1、根据tris-hcl的体积确定无机钠盐、s9表面活性剂、螯合剂和bsa的质量，将上述原料混合均匀制得样品垫处理液；
32.s2、使用喷金仪将样品垫处理液均匀喷涂于玻璃纤维上，控制喷涂量为8～10μl/cm(如9μl/cm)，控制喷涂宽度为1.5～2cm，喷涂条数为3条；
33.s3、完成喷涂后在50～60℃下干燥18～24小时，制得样品垫待用。
34.人的唾液中水分占80％以上，剩余的是有机物和无机物，其中，有机物主要有黏蛋白、粘多糖、唾液淀粉酶等，无机物包括钠离子、钾离子、钙离子、氯离子及碳酸氢根离子等。唾液中的黏蛋白等蛋白质有机物是影响唾液在样品垫上流动的关键因素，因此一般是需要先对唾液进行预处理，将预处理后的唾液稀释液样品滴加在样品垫上进行检测。
35.本发明的样品垫可以应用于胶体金免疫层析试纸条使用，可在样品垫上直接添加唾液样本，唾液在经过样品垫上的喷涂线时，无机钠盐溶于唾液中水解，一方面与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜，另一方面又大量中和蛋白质颗粒上的电荷，使将唾液中的蛋白质析出。由于无机钠盐处于喷涂线位置，唾液运动到喷涂线时，无机钠盐有溶解于唾液中的趋势，有利于提高唾液向前运动的速度，同时由于唾液中蛋白质析出，唾液
的粘度下降，也有利于提高唾液向前运动的速度，两者叠加，在宏观表现为明显提高唾液在样品垫上的液流速度，形象地表示为样品垫中的无机钠盐在拖拽唾液前进。
36.在本发明中，中性的无机钠盐可以是阴离子为强酸酸根离子的钠盐，本发明优选采用中性的氯化钠，因为氯化钠不会改变唾液的离子环境，对唾液与后续的胶体金垫结合不会产生影响。
37.在本发明中，螯合剂可以是四苯硼酸钠和/或草酸钠，其中，四苯硼酸钠可使唾液中的钾离子和钙离子沉淀，草酸钠可使唾液中的钙离子沉淀，本发明通过螯合剂来改变唾液的离子环境，避免唾液中的金属离子对唾液与胶体金垫接触时产生影响。
38.需要说明的是，本发明相比于现有技术对唾液的检测存在以下优点：
39.一、本发明通过样品垫对唾液进行预处理，唾液在样品垫中流动过程中，将唾液中的黏蛋白及钾钙离子以沉淀形式析出，缩短了唾液样品的处理步骤及处理时间。
40.二、本发明有效地提高了唾液在试纸条上的液流速度，使直接快速地检测唾液样本成为可能，本发明利用样品垫内的无机钠盐有在唾液中水解的趋势，有效地提高了唾液向样品垫上的喷涂线流动的速度，而且在唾液流过喷涂线后，喷涂线内的无机钠盐及螯合剂使唾液内的黏蛋白等杂蛋白及钾钙离子沉淀析出，进一步提高唾液的液流速度，唾液也将喷涂线内的s9表面活性剂及bsa重新溶解，为下一步与胶体金的结合作准备。
41.基于上述的样品垫处理液及样品垫，本发明也提供了一种用于检测唾液bar原药的试纸条，包括底板及设置于底板上依次搭接的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫是由样品垫处理液喷涂在玻璃纤维上形成；
42.具体地，胶体金垫上喷涂有胶体金标记羊抗鼠igg抗体及胶体金标记bar抗体，制备方法如下：
43.将羊抗鼠igg与胶体金颗粒结合形成胶体金标记羊抗鼠igg抗体探针，bar抗体与胶体金颗粒结合形成胶体金标记bar抗体探针，将以上抗体探针在复溶稀释液中混匀，其中，胶体金标记bar抗体的浓度为20％，胶体金标记羊抗鼠igg抗体的浓度为5％，通过喷金仪将复溶混合溶液均匀喷涂于玻璃纤维上，喷涂量2.25μg/cm，宽度1cm，喷涂线条数为1条，在37℃烘干18～24小时，制得胶体金垫待用。
44.具体地，硝酸纤维素膜上设有包被bar抗原的t检测线和包被鼠抗人igg抗体的c控制线，制备方法如下：
45.制备包被浓度为0.3mg/ml的bar抗原的包被溶液，通过喷膜机划线喷涂在硝酸纤维素膜上形成t检测线；制备包被浓度为0.6mg/ml的鼠抗人igg抗体的包被溶液，通过喷膜机划线喷涂在硝酸纤维素膜上形成c控制线，将完成喷涂后的硝酸纤维素膜置于50℃烘干18～24小时。
46.下面以具体实施例详细介绍本发明的样品垫处理液及样品垫。
47.以制备用于检测唾液bar原药的试纸条为例，样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接，其中，胶体金垫及硝酸纤维素膜按上述步骤制作。需要说明的是，本发明试纸条的测试原理是竞争法，当c控制线及t检测线同时显色，则结果判定为阴性，当c控制线显色，t检测线不显色，则结果判断为阳性，因此下面主要以t检测线的显色程度作为判断依据。
48.实施例1
49.采用氯化钠配置样品垫处理液及制作样品垫，分别以碳酸钠、硫酸铵、磷酸钾及硫酸镁替代无机钠盐配置样品垫处理液及制作样品垫，作为对比试验，样品垫处理液的其余成分相同，将上述样品垫分别制作试纸条，用于检测三组阳性唾液样本(p1、p2、p3)及三组阴性唾液样本(n1、n2、n3)，检测结果如下表1所示，其中，三组阴性样本是指三个健康志愿者的唾液待测样品，三组阳性样本是指在三个健康志愿者的唾液内添加bar标准品制得bar浓度分别为50ng/ml、75ng/ml和100ng/ml的唾液待测样品。
50.用移液器滴加70μl待测物到本实施例制得的试纸条上，由于毛细管作用，样品将沿着试纸条向胶体金垫和硝酸纤维素膜移动，待样本完全溶解胶体金颗粒并向硝酸纤维素膜流动，结果开始显示；5分钟观察显示结果(注：10分钟后显色无效)。测试结果如表1所示：
51.注：共10个显色梯度：c1～c9，b。其中b表示“blank”，无条带；c1～c9表示显色强度，其中数字越大表示显色越浅。c8+表示显色介于c8～c7，其他以此类推。
52.表1无机盐对试纸条检测结果的影响
53.[0054][0055]
根据氯化钠组的检测结果可知，样品垫处理液中无机钠盐的浓度与层析现象成正相关，无机钠盐的浓度越高，层析显色越明显，中性的无机钠盐有效地将唾液中的杂蛋白在样品垫处析出，减少唾液杂蛋白对层析结果产生影响，根据氯化钠组、碳酸钠组及对比组别的层析现象比较可知，浓度在5％以上的氯化钠就已经能提高胶体金颗粒的释放速度，这也表明了，氯化钠可有效地提高唾液在试纸条内的液流速度，对于碳酸钠组，当浓度达到5％以上时，也能有效提高唾液液流速度，但是会出现水金分离的情况，这是因为碳酸钠溶液为碱性，水解后，碳酸根离子对于唾液与胶体金的结合环境有负面影响，根据氯化钠组和碳酸钠组的褪白速度比较可知，氯化钠提高唾液液流速度的效果明显优于碳酸钠。
[0056]
氯化钠组对于阴性样本和阳性样本的显色结果区别较明显，当氯化钠浓度达到10％时，阴性样本的显色梯度为c4(颜色深)，阳性样本的显色梯度为c8(颜色非常浅)，而其他组别的阴性样本显色不明显，与阳性样本显色情况接近，难以区分，说明本发明的样品垫可对bar原药测试的唾液样本进行较好的处理，使胶体金标记羊抗鼠igg抗体及胶体金标记bar抗体与唾液的结合得到改善。
[0057]
实施例2
[0058]
分别采用四苯硼酸钠和草酸钙配置样品垫处理液及制作样品垫，分别以乙二胺四乙酸二钠和磷酸二氢钙替代螯合剂配置样品垫处理液及制作样品垫，作为对比试验，样品垫处理液的其余成分相同，将上述样品垫分别制作试纸条，用于检测三组阳性唾液样本(p1、p2、p3)及三组阴性唾液样本(n1、n2、n3)，检测结果如下表2所示。
[0059]
表2螯合剂对试纸条检测结果的影响
[0060][0061]
从表2可知，螯合剂(即四苯硼酸钠和草酸钙)的效果与常规的螯合剂效果接近，甚至当添加量大于0.5％时，四苯硼酸钠的效果优于edta二钠(乙二胺四乙酸二钠)，在本发明中，唾液样本是直接添加在样品垫上，考虑到唾液的液流速度及唾液与胶体金标记物结合，螯合剂明显优于螯合剂，将钾钙离子等从唾液中除去，提高唾液液流速度，改善唾液与胶体金标记物结合。
[0062]
实施例3
[0063]
唾液比血液、尿液的成分更为复杂，个体差异受饮食习惯、体质、年龄、性别等影响，唾液成分的比例、粘稠度、酸碱度都会不同。因此本发明处理对样品垫处理液的成分有特定要求外，对于样品垫的制备工艺参数也非常关键，要保证样品垫能将唾液中干扰物质处理掉，除了三组阳性唾液样本(p1、p2、p3)及三组阴性唾液样本(n1、n2、n3)外，还另检测10名不限性别年龄的志愿者的真实唾液样本(r1-r10)，以下对样品垫的制备参数做以下筛选，如表3所示，其中，样品垫处理液的成分为：每100ml的浓度为200mm的tris-hcl缓冲液，氯化钠的添加量是25g，s9表面活性剂的添加量是1.5g，四苯硼酸钠的添加量是0.85g，bsa的添加量为1g。
[0064]
表3样品垫制备参数对试纸条检测结果的影响
[0065][0066]
根据表3结果可知，喷涂量及喷线数的提高可以让样品垫起到更好的阻断干扰的作用，样品垫宽度提高，当唾液加在样品垫上层析时，在层析过程中，样品垫的有效成分与唾液的接触面积增加，更好地将唾液中的干扰物质除去，使唾液与胶体金标记物的反应环境更有利于结合。而且根据表3可知，样品垫处理液的用量增加，对于唾液的处理效果越好，因此本发明的样品垫控制喷涂量为8～10μl/cm，宽度为1.5～2cm，喷涂线条数为3条
[0067]
以上对本发明所提供的实施例进行了详细阐述。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的原理的前提下，还可以本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。