一种柿蒂样品UPLC特征图谱的构建方法及检测方法与流程

本发明涉及中药分析和中药质量控制领域，具体涉及一种柿蒂样品uplc特征图谱的构建方法及检测方法。

背景技术：

1、柿蒂为柿树科植物柿(diospyros kaki thunb.的干燥宿萼，于冬季果实成熟时采收，食用时收集，洗净，晒干。中医认为，本品味苦、涩，性平，入胃经，有降气止呃之效，适用于胃失和降所致的呃逆等症。目前，从柿蒂中分离得到的有黄酮类、三萜类、鞣质类、有机酸类、香豆素类、甾醇类等化学成分。柿蒂味苦涩，性温，常用于治降逆气、止呕吐的症状。柿蒂经常与丁香在一起治疗呃逆。此外，柿蒂丁香可以治疗返流性食管炎、功能性消化不良、慢性胃炎。

2、我国柿树资源丰富，产区分布广泛，生长环境复杂，导致不同产地、来源的商品药材质量良莠不齐。中药指纹图谱或特征图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，可用于评价中药材、中药制剂以及半成品质量，能够系统、整体、专属地来表征中药的内在特征，已作为一种有效评价中药质量的方法被世界卫生组织所接受。通过将中药材或其制剂的各化学成分进行提取，采用特定的中药分析方法得到可以体现其各成分特征的色谱图。其是对中药整体信息的体现，实现起来相对比较困难。目前为止能揭示柿蒂内在质量的特征图谱或指纹图谱研究较少：周本宏等人采用hplc法测定柿蒂药材的指纹图谱(周本宏等.柿蒂药材的高效液相色谱指纹图谱研究[j].广东药学院学报,2011,27(02):147-150.)，流动相为甲醇-0.5％醋酸，洗脱梯度120min，检测波长为264nm，共检测10批柿蒂药材。李烨等采用hplc法建立了柿蒂药材的特征图谱方法，流动相为乙腈-0.01％磷酸，洗脱梯度120min；检测波长313nm，共检测12批柿蒂药材。上述研究只针对药材，而忽略了汤剂中的水溶性有效成分，较难反映柿蒂的临床效果，缺乏一定的谱效联系，难以深入认识柿蒂物质基础从药材到标准汤剂再到配方颗粒成品的工艺过程中的传递情况，另外，上述研究均采用hplc法检测，检测时间较长为120min，检验批次较少。因此，为保证从药材到标准汤剂到配方颗粒，这个过程中化学成分的一致性，有必要建立一种全面、准确、快速、专属性强的检测方法，该检测方法不仅能够检测柿蒂药材，还适用于柿蒂标准汤剂及其配方颗粒等的检测，对柿蒂现代制剂的质量检测至关重要。

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、为了解决现有技术的上述问题，本发明的目的在于提供一种柿蒂样品uplc特征图谱的构建方法，通过该方法构建的特征图谱能整体控制柿蒂样品的质量。

3、进一步地，本发明的目的还在于提供一种柿蒂样品的检测方法，该方法简单快速、结果客观、精密可靠、专属性强、灵敏度高。

4、用于解决问题的方案

5、通过发明人长期的研究，发现通过如下技术方案的实施能够解决上述技术问题：

6、一种柿蒂样品uplc特征图谱的构建方法，其中，所述构建方法包括如下步骤：

7、(a)对照品溶液制备：分别取原儿茶酸对照品、金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品、槲皮素对照品、山柰素对照品制备对照品溶液；

8、(b)供试品溶液制备：用提取溶剂对柿蒂样品进行提取，收集提取液，制备供试品溶液，所述柿蒂样品为柿蒂药材、柿蒂饮片、柿蒂标准汤剂、含柿蒂的制剂中间体和/或制剂成品；

9、(c)特征图谱的建立：采用超高效液相色谱法对所述对照品溶液和所述供试品溶液进行检测，相应获得对照图谱和检测图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统建立特征图谱；

10、所述超高效液相色谱法的色谱条件包括：

11、固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径为1.5～2μm的色谱柱；

12、流动相：以乙腈为流动相a，以0.05～0.30wt％磷酸溶液或水为流动相b；

13、梯度洗脱程序：

14、0min～5min，所述流动相a的体积百分比由10％上升至14％；5min～20min，所述流动相a的体积百分比由14％上升至25％；20min～30min，所述流动相a的体积百分比由25％上升至40％。

15、根据[1]所述的构建方法，其中，所述构建方法还包括如下步骤：利用液质联用技术对色谱特征峰进行指认。

16、根据[1]或[2]所述的构建方法，其中，所述特征图谱包含10个峰，其中峰1为原儿茶酸、峰3为金丝桃苷、峰4为异槲皮苷、峰6为山柰酚-7-o-β-d-葡萄糖苷、峰7为三叶豆苷、峰9为槲皮素、峰10为山柰素。

17、根据[3]所述的构建方法，其中，以峰4为参照峰，计算各峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％之内，峰1～峰10对应的规定值分别为0.19，0.49，0.95，1.00，1.10，1.15，1.25，1.37，1.90，2.3。

18、根据[1]～[4]任一技术方案所述的构建方法，其中，所述提取溶剂选自甲醇或者包含甲醇体积百分比为20％～80％的甲醇水溶液。

19、根据[1]～[5]任一技术方案所述的构建方法，其中，所述色谱条件还包括：流速为0.25ml/min～0.35ml/min；和/或，柱温为33℃～37℃；和/或，检测波长为240～270nm。

20、根据[1]～[6]任一技术方案所述的构建方法，其中，所述柿蒂样品为柿蒂药材，所述提取溶剂为甲醇体积百分比为60％～80％的甲醇水溶液，提取方式为加热回流40～80分钟。

21、根据[1]～[6]任一技术方案所述的构建方法，其中，所述柿蒂样品为柿蒂标准汤剂或柿蒂配方颗粒，所述提取溶剂为甲醇体积百分比为60％～80％的甲醇水溶液，提取方式为超声处理，超声提取的时长为20min～60min、功率为220w～300w、频率为35khz～45khz。

22、一种柿蒂样品的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：

23、用提取溶剂对待测柿蒂样品进行提取，收集提取液，制备待测品溶液；所述柿蒂样品为柿蒂药材、柿蒂饮片、柿蒂标准汤剂、含柿蒂的制剂中间体和/或制剂成品；

24、采用超高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，并将检测所得检测图谱与[1]～[8]任一技术方案构建方法构建的特征图谱进行比较以检测柿蒂样品的质量和/或真伪；

25、所述超高效液相色谱法的色谱条件包括：

26、固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径为1.5～2μm的色谱柱；

27、流动相：以乙腈为流动相a，以0.05～0.30wt％磷酸溶液或水为流动相b；

28、梯度洗脱程序：

29、0min～5min，所述流动相a的体积百分比由10％上升至14％；5min～20min，所述流动相a的体积百分比由14％上升至25％；20min～30min，所述流动相a的体积百分比由25％上升至40％。

30、根据[9]的检测方法，其中，所述提取溶剂选自甲醇或者包含甲醇体积百分比为20％～80％的甲醇水溶液。

31、发明的效果

32、本发明通过采用超高效液相色谱法，并对色谱条件进行合理控制，找出同时适用于柿蒂药材及其标准汤剂和配方颗粒等柿蒂样品的超高效液相色谱条件，从而构建柿蒂样品的特征图谱。本发明的特征图谱包含10个特征峰，使柿蒂的质量控制从原来的单个成分的含量测定或少数几个共有峰的测定，上升到对整个柿蒂内在品质的把控。在本发明的一些具体实施方式中，通过对药材、标汤、颗粒测定能够比较全面地反应柿蒂的特征，避免了单一或少数几个峰测定的缺陷，可以为柿蒂的内在质量控制提供新的分析手段，为柿蒂及其现代制剂的质量检测提供了有效的方法，也为柿蒂及其现代制剂的质量综合评价提供了科学的实验依据。

33、本发明方法简单，重现性好，准确可靠，便于操作，相比于hplc来说，节约时间，通过优化色谱条件使得检测时间缩短为30min，溶剂消耗量少，对环境污染小。本发明的图谱各特征峰分离度较好，通过对照品及质谱信息确认了全部特征峰的化学信息，专属性较强，分析效率高，稳定性高，重复性好，适用范围广，而且适用于柿蒂药材标准汤剂及配方颗粒等产品的检测，尤其适合规模化生产的检测与监控。

34、需要说明的是，上述的记载并不是公开了本发明的全部实施方式和本发明的全部优点。