一种斑马鱼成鱼质谱成像分析方法

1.本发明涉及一种斑马鱼成鱼质谱成像分析方法，属于免标记分子成像技术领域。


背景技术：

2.斑马鱼在组织学、分子学和遗传学上与人类具备一定的相似性，它已经成为人类疾病研究的优良生物材料(m.astone,e.n.dankert,s.k.alam,et al.fishing for cures: the allure of using zebrafish to develop precision oncology therapies.npj precis.oncol. 2017,1:39.；s.kirchberger,c.sturtzel,s.pascoal,et al.quo natas,danio-recentprogress in modeling cancer in zebrafish.front oncol 2017,7:186)。与目前应用最广泛的实验鼠相比，斑马鱼具有独特的优势。首先，斑马鱼繁殖能力强，生长速度快，可进行高通量研究(b.costa,m.f.estrada,r.v.mendes,et al.zebrafish avatars towardspersonalized medicine-a comparative review between avatar models.cell 2020,9(2):293.)；其次，斑马鱼的体型较小，可以进行全身检测，允许观察到疾病引起的全身反应；第三，斑马鱼在胚胎期免疫系统发育不成熟，大约80％的移植肿瘤细胞可以在其体内存活，是构建个体化肿瘤模型的理想生物。鉴于斑马鱼模型在疾病研究中的重要作用，系统地了解其分子信息至关重要。目前，较多的研究集中于斑马鱼的基因和蛋白质水平；在代谢水平上，多数研究都集中在脂质代谢上，仍然缺乏对斑马鱼整体代谢谱的深入了解。
3.质谱成像(msi)技术具有无需特异性标记、检测对象广、灵敏度高以及能够同时获得分子结构信息、分布信息等特点和优势，在生命科学领域具有重大应用前景因而备受关注(wang j,xue j,yan z,et al.photoluminescence lifetime imaging ofsynthesized proteins in living cells using an iridium
–
alkyne probe.angew.chem.int.ed., 2017,56(47):14928-32.；wang j,wang z,liu f,et al.vacuum ultraviolet laserdesorption/ionization mass spectrometry imaging of single cells with submicron craters. anal.chem.,2018,90(16):10009-15.；calligaris d,caragacianu d,richardson al,et al. application of desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging in breastcancer margin analysis.proc.natl.acad.sci.usa.,2014,111(42):15184-9.)。空气动力辅助离子化质谱成像(afadesi-msi)技术能够进行大体积和远距离样本的分析，运用该技术已创建了无需切割的整体动物体内药物分析的质谱分子成像新方法，并成功应用于抗癌候选新药的整体动物组织分布成像研究，为药物靶向、药效与毒理机理研究提供了新的直观方法(luo z,he jj,abliz z,et al.air flow-assisted ionizationimaging mass spectrometry method for easy whole-body molecular imaging under ambientconditions.anal.chem.,2013,85(5):2977-2982.)。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种斑马鱼成鱼的质谱成像分析方法，为一种基于质谱成像
技术的斑马鱼成鱼的代谢物原位可视化方法，利用非靶向的afadesi-msi分析方法，对斑马鱼成鱼的空间分辨代谢组进行分析。
5.本发明提供的斑马鱼成鱼的质谱成像分析方法，包括如下步骤：
6.s1、将斑马鱼制成斑马鱼冰冻组织切片；
7.s2、将所述斑马鱼冰冻组织切片进行afadesi-msi分析，即实现对斑马鱼成鱼的质谱成像分析。
8.上述的质谱成像分析方法中，步骤s1中，采用水作为包埋介质制备所述斑马鱼冷冻组织切片；
9.本发明具体实施方式考察了不同包埋介质的效果：h2o、5％cmc-na、10％明胶以及5％cmc-na+10％明胶，结果表明，几种包埋介质条件下检出的离子数目相差不大，但是在共同检出的离子中，以水作为包埋介质时，绝大多数离子的响应强度最高。
10.上述的质谱成像分析方法中，步骤s1中，所述斑马鱼冷冻组织切片的厚度为12 μm～15μm，优选12μm或15μm；
11.本发明具体实施方式考察了不同厚度所述斑马鱼冷冻组织切片的分析效果，结果表明，不同厚度条件下检出的离子数目相差不大。然而，在正离子模式下，厚度为 15μm时大部分离子的响应强度较高，而在负离子模式下为12μm。
12.上述的质谱成像分析方法中，步骤s2中，所述afadesi-msi分析中，喷雾电压为
±
3kv；
13.本发明具体实施方式考察了不同喷雾电压条件下的分析效果，结果显示，在正离子检测模式下，不同喷雾电压条件下检测到的峰数相差不大，3kv时共同检出离子的响应强度最大；在负离子检测模式下，-3kv时检测到的离子数目为778个，明显高于喷雾电压为0kv(452个)和-1.5kv(710个)两个条件，虽然该条件下共同检出离子的响应强度略低，但喷雾电压为0kv、-1.5kv时结果重复性较差。因此，本发明优选
±
3kv作为之后afadesi-msi分析的喷雾电压。
14.上述的质谱成像分析方法中，步骤s2中，所述afadesi-msi分析中，喷雾气压力为0.4～0.6mpa；
15.本发明考察了正、负离子模式下不同喷雾气压力(0.4mpa、0.6mpa、0.8mpa) 下的分析效果，结果表明，正离子模式下检出的离子数目相差不大；在负离子检测模式下，喷雾气压力为0.4mpa时检测到的平均离子数目为796个，明显少于0.6mpa (998个)、0.8mpa(1011个)两个条件。进一步将组织匀浆模型在3种喷雾气压力下检出的共同离子的强度进行分析。结果表明，在正离子模式下，当喷雾气压力为 0.6mpa时大多数离子数目的强度最高；在负离子模式下为0.4mpa。综上结果，本发明优选0.6mpa为最优喷雾气压力。
16.上述的质谱成像分析方法中，步骤s2中，所述afadesi-msi分析中，喷雾剂流速为7～9μl/min；
17.本发明具体实施方式分别在正、负离子模式下考察喷雾剂流速3μl/min、5 μl/min、7μl/min、9μl/min对代谢物检测的影响。在正离子检测模式下，检出的总离子数目在4种喷雾剂流速条件下相差不大；在负离子模式下，喷雾溶剂流速为7 μl/min和9μl/min时检出的离子数目较多，分别为1032个、1028个，明显高于3 μl/min(759)和5μl/min(684)。根据4种喷雾剂流速下检测出的共同离子的强度的对比结果，在正离子模式下大多数离子在喷
雾溶剂流速为9μl/min时可达到较高的响应强度；而在负离子模式下为7μl/min。考虑到过大的喷雾剂流速可能会将样品组织吹散，降低样品分析的空间分辨率并污染质谱仪离子源，本发明优选7μl/min 为最佳的喷雾剂流速。
18.上述的质谱成像分析方法中，步骤s2中，所述afadesi-msi分析中，喷雾溶剂为甲醇与水的混合液，两者的体积比为8：1～3；
19.本发明具体实施方式针对组织匀浆模型，在正、负离子检测模式下，考察了包括 acn/h2o(5:5，v/v)、acn/h2o(8:2，v/v)、acn/ipa/h2o(4:4:2，v/v/v)、acn/ipa/h2o (6:2:2，v/v/v)、meoh/h2o(5:5，v/v)、meoh/h2o(8:2，v/v)、meoh/ipa/h2o(4:4:2， v/v/v)和meoh/ipa/h2o(6:2:2，v/v/v)在内的8种喷雾溶剂体系对内源性代谢物检测的灵敏度以及覆盖度的影响。在正、负离子模式下，当喷雾溶剂体系为meoh/h2o (8:2，v/v)时可实现更多代谢物的检出。为进一步考察不同喷雾溶剂体系对内源性代谢物响应强度的影响，提取了一组已知结构类别的内源性代谢物的质谱图像。大部分内源性代谢物在喷雾溶剂体系为meoh/h2o(8:2，v/v)时呈现出更高的离子响应强度。综上实验结果，本发明优选meoh/h2o(8:2，v/v)作为斑马鱼成鱼afadesi-msi 质谱成像分析的最佳喷雾溶剂体系。
20.本发明提供的非靶向的afadesi-msi分析方法，能够进行斑马鱼成鱼的空间分辨代谢组分析，能够在正、负离子模式下检测到超过1000个代谢物，其中数百个代谢物具有器官特异性分布。本发明方法能够提供斑马鱼代谢水平全局分子信息，并进一步推动斑马鱼疾病模型的拓展应用。
附图说明
21.图1为本发明实施例2中斑马鱼afadesi-msi分析方法的参数考察与优化。
22.图2为本发明实施例2中斑马鱼afadesi-msi分析方法中喷雾溶剂的考察结果。
23.图3为本发明实施例3中检测到的已鉴定脂类代谢物数目统计及代表性脂类代谢物的afadesi-msi图。
24.图4为本发明实施例4检测的具有组织器官特异性分布的代谢物。
具体实施方式
25.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
26.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
27.下述实施例中所用的试剂和材料如下：
28.hplc级乙腈、异丙醇、甲醇、乙醇购自德国merck公司。纯化水取自娃哈哈(中国杭州)。明胶和羧甲基纤维素钠(na-cmc)购自sigma-aldrich公司(st.louis,mo, usa)；正电荷防脱载玻片(cat#188105)购于中国江苏省；苏木伊红h&e染色试剂盒、盐酸乙醇慢速分化液购自碧云天生物技术公司；氨水(gr，25％～28％)购自上海阿拉丁生化科技有限公司；二甲苯(分析纯)购自北京化工厂。
29.实施例1、斑马鱼冰冻组织切片的制备及afadesi-msi分析方法
30.1、斑马鱼冰冻组织切片的制备
31.所用成年斑马鱼均为野生型。将斑马鱼饥饿处理24h后置于冰水混合物中处死。在液氮中快速冷冻后，将其置于3
×
3cm的凝胶冷冻模具，嵌入包埋介质溶液中。之后将整个模
具保存在-80℃冰箱中冷冻。随后，使用冰冻切片机(cm1860，cm1860, leica microsystem ltd.,germany)于-22℃下，在最大矢状面处切割一定厚度的冰冻切片。afadesi-msi分析用的切片在真空干燥器中干燥6h，相邻切片进行苏木精
‑ꢀ
伊红(h&e)染色。
32.2、组织切片的h&e染色
33.将制备好的的斑马鱼冰冻组织切片置于4℃乙醇中，固定10min。组织切片固定完成后，先用纯净水冲洗30s，然后依次用95％乙醇、70％乙醇和纯净水分别冲洗30 s。苏木精染色45s后用纯净水冲洗30s，之后置于分化液中分化10s。经纯净水再次冲洗30s后返蓝30s，依次用纯净水、70％乙醇、95％乙醇冲洗30s后用伊红染色 45s，然后分别用95％乙醇和100％乙醇冲洗30s。将载玻片在二甲苯中浸泡2m，最后用中性树脂和盖玻片进行封片。
34.3、组织匀浆模型制备
35.将全身组织和生理盐水按1g/3ml的比例混合，利用组织匀浆仪制备斑马鱼匀浆。将3μl等量匀浆加入到载玻片上3
×
5mm的类矩形孔中以制备组织匀浆模型，这些类矩形孔是由事先打孔的pvc薄膜黏附于载玻片上形成的。组织匀浆模型作为 afadesi-msi分析方法建立过程中参数优化时的代表性样品。分析前，所有样品均在真空中干燥6小时。
36.4、afadesi-msi分析
37.样品检测采用afadesi-msi平台与q-ot-qit混合质谱仪(orbitrap fusion lumos, thermo fisher scientific,usa)进行。采用meoh/h2o(8:2,v/v)作为喷雾溶剂，流速为7 μl/min。喷雾电压为+3kv/-3kv，毛细管温度为350℃。喷雾气压力设置为0.6mpa，抽气流速为45l/min。afadesi-msi数据通过full-scan模式扫描，在正离子和负离子模式下获得。其余ms参数设置如下:扫描范围m/z 100-1000；自动增益控制目标 (agc target)1e6；最大注入时间100ms；分辨率120000。
38.5、数据处理
39.massimager用于离子图像重建和背景扣除。根据匹配的h&e图像选择感兴趣区域(roi)。hmdb(http://hmdb.ca/)和metlin(http://metlin.scripps.edu)为高分辨率m/z 提供参考，质量精度小于5ppm。然后，利用ms/ms扫描模式对所有可能的内源代谢物进行靶向分析，并根据数据库检索和以往的经验对已知代谢物进行识别。
40.实施例2、斑马鱼的afadesi-msi分析关键参数优化及结果
41.由于斑马鱼体型较小，内部结构复杂，以不同条件下可检测的离子数目、离子强度、代表性代谢物强度等为考察指标，对afadesi-msi分析方法中以下参数进行了系统地考察和优化，包括：
42.(1)包埋剂类型：h2o、5％cmc-na、10％明胶以及5％cmc-na+10％明胶；
43.(2)组织切片厚度：12μm，15μm，20μm，25μm；
44.(3)喷雾电压：0kv，
±
1.5kv，
±
3kv
45.(4)喷雾气压力：0.4mpa，0.6mpa，0.8mpa；
46.(5)喷雾溶剂流速：3μl/min，5μl/min，7μl/min，9μl/min；
47.(6)喷雾溶剂系统：acn/h2o(5:5，v/v)、acn/h2o(8:2，v/v)、acn/ipa/h2o (4:4:2，v/v/v)、acn/ipa/h2o(6:2:2，v/v/v)、meoh/h2o(5:5，v/v)、meoh/h2o (8:2，v/v)、meoh/ipa/h2o(4:4:2，v/v/v)和meoh/ipa/h2o(6:2:2，v/v/v)。
48.1、斑马鱼组织相邻切片和组织匀浆模型制备方法的重复性考察
49.首先，考察了组织匀浆模型和相邻组织切片制备方法的重复性。根据5张连续切片和6个组织匀浆模型样品的主成分分析可知，离子响应强度变化均在
±
2sd范围内，说明两种样品制备方法的稳定性良好。此外，对一组已知的不同结构类别的代谢物进行了检测，包括胆碱([m+h]
+
m/z 104.1070)、pc-38:4([m+na]
+
m/z 832.5827)、 fa-18:3([m-h]-m/z 277.2173)、lyso pi-18:0([m-h]-m/z 599.3202)、精氨酸([m+h] ‑
m/z 175.1190)、葡萄糖([m+cl]-m/z 215.0328)、肌苷([m+na]
+
m/z 136.0488)、 pc-38:6([m+na]
+
m/z 828.5517)、9,10-环氧十八烷酸(9,10-eoa[m-h]-m/z 295.2278)、 fa-20:5([m-h]-m/z 301.2182)。统计分析表明，这些代谢物在相邻切片和组织匀浆模型中的响应强度的rsd值均小于20％。
[0050]
2、组织包埋剂考察
[0051]
本发明采用组织匀浆模型考察了h2o、5％ cmc-na、10％明胶和5％ cmc-na+10％明胶混合4种包埋剂。结果表明，4种包埋剂条件下检出的离子数目相差不大，但是在共同检出的离子中，以h2o为包埋介质时，绝大多数离子的响应强度最高(如图1所示)。因此，本发明优选h2o进行后续的afadesi-msi分析。
[0052]
3、冰冻组织切片厚度考察
[0053]
本发明考察了4种不同厚度的斑马鱼成鱼的整体组织冰冻切片，即12μm、15μm、 20μm、25μm。结果表明，4种切片厚度条件下检出的离子数目相差不大。然而，在正离子模式下，厚度为15μm时大部分离子的响应强度较高，而在负离子模式下为 12μm(如图1所示)。综合上述结果，本发明优选选择15μm、12μm分别作为斑马鱼冰冻组织切片在正、负离子模式下分析的最佳厚度。
[0054]
4、喷雾电压考察
[0055]
本发明将喷雾电压分别设定为0kv、
±
1.5kv、
±
3kv，对组织匀浆模型进行 afadesi-msi分析，考察其对代谢物检测的影响。在正离子检测模式下，3种喷雾电压条件下检测到的峰数相差不大，3kv时共同检出离子的响应强度最大(如图1)；在负离子检测模式下，-3kv时检测到的离子数目为778个，明显高于喷雾电压为0kv (452个)和-1.5kv(710个)两个条件，虽然该条件下共同检出离子的响应强度较低，但喷雾电压为0kv、-1.5kv时结果重复性较差。因此，本发明优选
±
3kv作为之后afadesi-msi分析的喷雾电压。
[0056]
5、喷雾气压力考察
[0057]
本发明采用组织匀浆模型考察正、负离子模式下3种喷雾气压力，包括0.4mpa、 0.6mpa、0.8mpa。结果表明，正离子模式下检出的离子数目相差不大；在负离子检测模式下，喷雾气压力为0.4mpa时检测到的平均离子数目为796个，明显少于0.6 mpa(998个)、0.8mpa(1011个)两个条件。进一步将组织匀浆模型在3种喷雾气压力下检出的共同离子的强度进行分析。结果表明(如图1所示)，在正离子模式下，当喷雾气压力为0.6mpa时大多数离子数目的强度最高；在负离子模式下为0.4 mpa。综合上述结果，本发明优选0.6mpa为喷雾气压力。
[0058]
6、喷雾剂流速考察
[0059]
针对斑马鱼组织匀浆模型进行afadesi-msi分析，分别在正、负离子模式下考察喷雾剂流速3μl/min、5μl/min、7μl/min、9μl/min对代谢物检测的影响。在正离子检测模式下，检出的总离子数目在4种喷雾剂流速条件下相差不大；在负离子模式下，喷雾溶剂流速为7μl/min和9μl/min时检出的离子数目较多，分别为1032、 1028个，明显高于3μl/min(759)和5
μl/min(684)。根据4种喷雾剂流速下检测出的共同离子的强度的对比结果(如图1所示)，在正离子模式下大多数离子在喷雾溶剂流速为9μl/min时可达到较高的响应强度；而在负离子模式下为7μl/min。考虑到过大的喷雾剂流速可能会将样品组织吹散，降低样品分析的空间分辨率并污染质谱仪离子源，最终确定7μl/min为最佳的喷雾剂流速。
[0060]
7、喷雾溶剂体系对内源性代谢物检测的影响
[0061]
针对组织匀浆模型，在正、负离子检测模式下，考察了包括acn/h2o(5:5，v/v)、 acn/h2o(8:2，v/v)、acn/ipa/h2o(4:4:2，v/v/v)、acn/ipa/h2o(6:2:2，v/v/v)、 meoh/h2o(5:5，v/v)、meoh/h2o(8:2，v/v)、meoh/ipa/h2o(4:4:2，v/v/v)和 meoh/ipa/h2o(6:2:2，v/v/v)在内的8种喷雾溶剂体系对内源性代谢物检测的灵敏度以及覆盖度的影响。在正、负离子模式下，当喷雾溶剂体系为meoh/h2o(8:2， v/v)时可实现更多代谢物的检出(如图2中a图)。为进一步考察不同喷雾溶剂体系对内源性代谢物响应强度的影响，提取了一组已知结构类别的内源性代谢物的质谱图像。如图2中b图所示，大部分内源性代谢物在喷雾溶剂体系为meoh/h2o(8:2， v/v)时呈现出更高的离子响应强度。综合考虑上述结果，最终选择meoh/h2o(8:2， v/v)作为斑马鱼成鱼afadesi质谱成像分析的最佳喷雾溶剂体系。
[0062]
通过上述考察和优化，本发明最终确定的afadesi-msi分析系统的关键参数的如表1中所示。
[0063]
表1斑马鱼afadesi-msi分析方法的条件
[0064][0065][0066]
实施例3、斑马鱼的空间分辨代谢组检测
[0067]
基于实施例2确定的条件，对正离子和负离子模式下斑马鱼成鱼组织的最大矢状截面进行afadesi-msi分析。
[0068]
通过质谱数据的图像重建，共检测到》1000个可明显观察到其空间分布信息的内源性代谢物。其中正离子模式403个，负离子模式814个。结合高分辨率ms和ms/ms 数据、同位素丰度比和数据库检索，鉴定出200多个代谢物。需要强调的是，该方法能够检测出的代谢物种类覆盖度高，包括脂类、胆碱、多胺、肉碱、氨基酸、核苷、核苷酸、有机酸、碳水化合物、胆固醇和胆酸。其中脂类代谢物信号是斑马鱼代谢谱的主要组成成分，包括磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰甘油(pg)、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酸(pa)和脂肪酸。已鉴定出的脂类代谢物数目及代表性脂类代谢物afadesi-msi图如图3所示。
[0069]
实施例4、斑马鱼的组织特异性分布代谢物检测
[0070]
基于实施例2确定的条件，采用afadesi-msi分析方法，结合h&e染色切片提供的组织学信息，提取了眼睛、大脑、鳃、心脏、肝脏、肾脏、肠道、肌肉和脊髓等9个器官区域的msi数据，筛选器官特异性功能代谢物。通过图像重构，得到了数百个具有空间分布特异性的内源性代谢物。例如(如图4所示)，离子m/z 900.5508 (+)和m/z 503.3396(-)呈现独特的眼分布；m/z 814.5355(+)和m/z 757.5789(-) 主要分布在脑区；m/z 392.1513(+)和m/z 663.2931(-)分布于心脏；m/z 822.5409 (+)和m/z 552.2753(-)仅分布于肌肉中；m/z 349.2349(+)主要分布在肝脏；m/z 337.2714(+)在鳃内具有特异性分布；m/z 483.3129(-)和m/z 282.2164(-)分别特异分布于肠和肾。上述结果表明，正离子和负离子模式生成的数据具有良好的互补性，并且可以根据代谢物对斑马鱼的不同器官区域进行分类。