一种同时检测样品中多种化合物的方法与流程

1.本发明涉及检测技术领域，具体而言，涉及一种同时检测样品中多种化合物的方法。


背景技术：

2.农药残留问题是随着农药大量生产和广泛使用而产生的。农药进入粮食、蔬菜、水果、鱼、虾、肉、蛋、奶等农产品中，造成食物污染，危害人的健康。因此，对农产品的农药残留检测显得尤为重要。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种同时检测样品中多种化合物的方法，本发明提供的检测方法可以同时对10种化合物进行检测，该方法线性关系良好，最小检出量低，正确度和精密度高。
4.本发明是这样实现的：
5.本发明提供一种同时检测样品中多种化合物的方法，所述多种化合物包括：腈菌唑、环丙唑醇、胺苯吡菌酮、氟环唑、噻氟菌胺、氟甲腈、氟虫腈、氟苯虫酰胺、氟虫腈砜、和氟铃脲；
6.所述方法包括如下步骤：
7.检测步骤：将待测样品经预处理后得到的上样样品用液相色谱-质谱联用仪进行检测，以获得上述各化合物的定量离子对峰面积；
8.定量分析步骤：基于上述各化合物的所述定量离子对峰面积获得各化合物的含量；
9.其中，所述预处理包括：将所述待测样品与乙醇混合提取，获得提取液；将所述提取液上固相萃取柱洗脱，收集洗脱液，作为所述上样样品。
10.本发明开发了可同时检测10种化合物的方法，为上述10种化合物的检测提供了高效、便捷、准确的定量方法，为这些化合物在农产品等诸多领域的检测提供了便利。
11.此外，本发明专利方法具有良好的灵敏度、准确度和精密度，满足多种农药及其相关化合物组分同时测定的分析要求，并且相比较现有的农药多残留分析方法，本发明在预处理中以完全无危害的乙醇代替了传统的乙腈、丙酮等试剂，仅采用少量乙醇实现了提前、净化，不仅降低了试验操作者的风险和试验条件，同时，最大程度实现了危害试剂的使用，避免了危险废弃物的产生，丰富农产品中农药残留分析方法，符合绿色分析化学原则。
12.可选地，在一些实施方案中，在所述检测步骤中，用液相色谱-质谱联用仪检测的色谱分析条件包括如下：
13.色谱柱：shim-pack gist c18-aq hp，100mm
×
2.1mm i.d.,1.9μm；
14.柱温：40℃；
15.流速：0.30ml/min；
16.进样量：2μl；
17.洗脱方式：梯度洗脱；
18.流动相：
19.a相：0.01％甲酸-2mmol/l甲酸铵甲醇溶液(含2mmol/l甲酸铵，0.01％甲酸，99.99％甲醇)，
20.b相：0.01％甲酸-2mmol/l甲酸铵水溶液(含2mmol/l甲酸铵，0.01％甲酸，99.99％水)。
21.可选地，在一些实施方案中，梯度洗脱的程序如下：
22.t/min流速(ml/min)a相(％)b相(％)0.00.33971.00.33971.50.315852.50.3505018.00.3703023.00.398227.00.398227.10.339730.0stop
ꢀꢀ
23.。
24.可选地，在一些实施方案中，在所述检测步骤中，用液相色谱-质谱联用仪检测的质谱分析条件包括如下：
25.离子源：电喷雾离子源esi；
26.扫描方式：
27.正离子模式：腈菌唑、环丙唑醇、胺苯吡菌酮、氟环唑、噻氟菌胺，负离子模式：氟甲腈、氟虫腈、氟苯虫酰胺、氟虫腈砜、氟铃脲；雾化器流量：3l/min；
28.加热器流量：10l/min；
29.接口温度：300℃；
30.dl温度：250℃；
31.干燥气流量：10l/min；
32.检测方式：多重反应监测(mrm)。
33.可选地，在一些实施方案中，上述各化合物的质谱检测参数如下表：
[0034][0035][0036]
本发明通过对色谱条件和质谱条件的合理控制，提供了一种可同时检测10种化合物的液质联用检测方法，该方法具有多种优点，如在0.001-0.1mg/l的浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数达到0.999-1.000；如各化合物检测的正确度可达70.2％-110.0％，精确度可达0.9％-16.8％；如最小检出量可达2
×
10-3
ng；如最小定量限可达0.002mg/kg。
[0037]
需要说明的是，上述分析条件中涉及的各项参数可在
±
1％的范围内波动。
[0038]
可选地，在一些实施方案中，所述待测样品为固体形式样品或液体形式样品。
[0039]
可选地，在一些实施方案中，所述待测样品来自植物。
[0040]
需要说明的是，本发明的检测方法也适用非植物组织来源的样品，例如牛奶、羊奶、鸡蛋等。
[0041]
可选地，在一些实施方案中，所述待测样品的来源包括但不限于草莓、番茄、黄瓜、梨、蓝莓、葡萄、茼蒿、生菜、桃、或其混合。
[0042]
可选地，在一些实施方案中，所述预处理包括：将所述待测样品置于第一离心管中，加入乙醇，第一次振荡提取，取上清液转移至另一离心管中；在第一离心管中加入水，振荡提取，合并两次上清液，得到所述提取液。
[0043]
可选地，在一些实施方案中，所述预处理包括：将所述提取液上固相萃取柱，用10％乙醇水溶液淋洗后用乙醇洗脱，收集洗脱液，作为所述上样样品。
[0044]
可选地，在一些实施方案中，所述预处理包括：
[0045]
称取待测样品2.00g于15ml离心管中，加入2ml乙醇，振荡提取10min，5000rpm离心5min，取上清液转移至50ml离心管中；在15ml离心管中加入5ml水，振荡提取5min，5000rpm离心5min，合并两次上清液，定容至20ml，取10ml作为提取液，待净化；
[0046]
分别用3ml乙醇和3ml 10％乙醇：90％水活化固相萃取柱，将上述10ml待净化的提取液上样，再用3ml 10％乙醇水溶液淋洗后用1.5ml乙醇洗脱；收集洗脱液作为上样样品。
[0047]
上述预处理步骤中涉及的参数可在
±
1％的范围内波动，本领域技术技术人员在上述内容基础上对各项参数进行的常规调整也属于本发明的保护范围。
[0048]
可选地，在本发明一些实施方式中，在定量分析步骤中，基于各化合物的定量离子对峰面积，采用外标法获得各化合物的含量。
[0049]
需要说明的是，当采用外标法定量时，本领域技术人员可基于本发明所公开的内容预先作出标准曲线，将各化合物的定量离子对峰面积代入标准曲线即可得到相关的含量结果。对此，本发明不对标准曲线的公式作任何限定，无论何种标准曲线，只要是基于本发明公开内容所作出的，均属于本发明的保护范围。
附图说明
[0050]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0051]
图1为化合物腈菌唑标准品(0.01mg/l)的液相色谱图(上)和离子质谱图(下)。
[0052]
图2为化合物环丙唑醇标准品(0.01mg/l)的液相色谱图(上)和离子质谱图(下)。
[0053]
图3为化合物胺苯吡菌酮标准品(0.01mg/l)的液相色谱图(上)和离子质谱图(下)。
[0054]
图4为化合物氟环唑标准品(0.01mg/l)的液相色谱图(上)和离子质谱图(下)。
[0055]
图5为化合物噻氟菌胺标准品(0.01mg/l)的液相色谱图(上)和离子质谱图(下)。
[0056]
图6为化合物氟甲腈标准品(0.01mg/l)的液相色谱图(上)和离子质谱图(下)。
[0057]
图7为化合物氟虫腈标准品(0.01mg/l)的液相色谱图(上)和离子质谱图(下)。
[0058]
图8为化合物氟苯虫酰胺标准品(0.01mg/l)的液相色谱图(上)和离子质谱图(下)。
[0059]
图9为化合物氟虫腈砜标准品(0.01mg/l)的液相色谱图(上)和离子质谱图(下)。
[0060]
图10为化合物氟铃脲标准品(0.01mg/l)的液相色谱图(上)和离子质谱图(下)。
具体实施方式
[0061]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产
品。
[0062]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0063]
实施例1
[0064]
1仪器
[0065]
1.1液质联用仪：岛津三重四级杆液质联用仪(lcms-8060；统计分析软件：labsolution version 5.97sp1)。
[0066]
1.2自动涡旋仪：talboys数显多管涡旋混合器。
[0067]
1.4超声波震荡仪：台式数控超声波清洗机kq-5200de。
[0068]
1.5移液器：100-1000μl、20-200μl。
[0069]
以及其它实验室常用仪器设备。
[0070]
2试剂和材料
[0071]
2.1甲醇：色谱纯。
[0072]
2.2乙醇：色谱纯。
[0073]
2.3甲酸：色谱纯。
[0074]
2.4甲酸铵：色谱纯。
[0075]
2.5固相萃取小柱：waters oasis hlb固相萃取小柱60mg/3ml。
[0076]
2.6参照物(标准品)信息
[0077]
混标：50μg/ml，由北京迪马科技有限公司提供。溶剂：乙腈
[0078]
本实施例提供检测10种农药的方法，包括如下步骤：
[0079]
(1)预处理：提取及净化
[0080]
称取待测样品(如果是固体样品先粉碎均匀，如果是液体直接取样)2.00g于15ml离心管中，加入2ml乙醇，振荡提取10min，5000rpm离心5min，取上清液至50ml离心管中。在15ml离心管中加入5ml水，振荡提取5min，5000rpm离心5min，合并两次上清液，定容至20ml，取10ml待净化。
[0081]
分别用3ml乙醇和3ml 10％乙醇：90％水活化固相萃取柱，将上述10ml待净化液上样，再用3ml 10％乙醇水溶液淋洗后用1.5ml乙醇洗脱，收集洗脱液，作为上样样品。
[0082]
(2)检测：
[0083]
采用页相色谱质谱联用仪检测，液相色谱条件：
[0084]
色谱柱：shim-pack gist c18-aq hp，100mm
×
2.1mm i.d.,1.9μm；
[0085]
柱温：40℃；
[0086]
流速：0.30ml/min；
[0087]
进样量：2μl；
[0088]
流动相：
[0089]
a相：0.01％甲酸-2mmol/l甲酸铵甲醇溶液(含2mmol/l甲酸铵，0.01％体积比甲酸，99.99％体积比甲醇)，
[0090]
b相：0.01％甲酸-2mmol/l甲酸铵水溶液(含2mmol/l甲酸铵，0.01％体积比的甲酸，99.99％体积比的水)
[0091]
梯度洗脱条件如下表1：
[0092]
表1
[0093]
t/min流速(ml/min)a相(％)b相(％)0.00.33971.00.33971.50.315852.50.3505018.00.3703023.00.398227.00.398227.10.339730.0stop
ꢀꢀ
[0094]
质谱条件：
[0095]
离子源：电喷雾离子源esi；
[0096]
扫描方式：正离子模式(腈菌唑、环丙唑醇、胺苯吡菌酮、氟环唑、噻氟菌胺)；负离子模式(氟甲腈、氟虫腈、氟苯虫酰胺、氟虫腈砜、氟铃脲)；
[0097]
雾化器流量：3l/min；
[0098]
加热器流量：10l/min；
[0099]
接口温度：300℃；
[0100]
dl温度：250℃；
[0101]
干燥气流量：10l/min；
[0102]
检测方式：多重反应监测(mrm)如下表2：
[0103]
表2
[0104][0105]
(3)定性定量测定
[0106]
待仪器稳定后，在上述液相色谱质谱条件下，样品中化合物的保留时间、碎片离子对等，与标准溶液中化合物分别保持一致(见图1-图10)。
[0107]
采用外标法定量测定，现配现用(采用基质标准溶液定量)。
[0108]
标准曲线：将50mg/l储备液(乙腈)用乙醇配制成2mg/l的工作液，再用空白基质溶液(将空白样品如草莓、番茄、黄瓜、梨、蓝莓、葡萄、茼蒿、生菜、或桃等按上述预处理方法后得到的上样溶液)稀释，配置成化合物浓度0.001、0.005、0.01、0.05、0.1mg/l的基质标准溶液，在上述液相色谱质谱条件下进行测定，以各化合物的基质标准溶液浓度与其监测离子峰面积作标准曲线，测定结果见表3-表12，表中浓度单位:mg/l，代表化合物浓度。
[0109]
表3腈菌唑在不同基质标准曲线
[0110][0111]
表4环丙唑醇在不同基质标准曲线
[0112][0113][0114]
表5胺苯吡菌酮在不同基质标准曲线
[0115][0116][0117]
表6氟环唑在不同基质标准曲线
[0118][0119]
表7噻氟菌胺在不同基质标准曲线
[0120]
[0121][0122]
表8氟甲腈在不同基质标准曲线
[0123][0124]
表9氟虫腈在不同基质标准曲线
[0125]
[0126][0127]
表10氟苯虫酰胺在不同基质标准曲线
[0128][0129][0130]
表11氟虫腈砜在不同基质标准曲线
[0131][0132]
表12氟铃脲在不同基质标准曲线
[0133][0134][0135]
根据结果获得上样样品的3,5-二氯苯胺的定量离子对峰面积，代入相同植物来源的标准曲线，经换算，即可得到待测样品中的各化合物的定量结果。
[0136]
最小检出量：在上述液相色谱质谱条件下，各化合物的最小检出量为2
×
10-3
ng。
[0137]
实施例2
[0138]
按照0.002mg/kg(最小定量限)、0.01mg/kg以及0.1mg/kg设置三个不同添加水平，在空白基质中添加3个不同浓度的化合物的标准溶液，每个浓度重复5次，用实施例1分析方法测定回收率，结果见表13。
[0139]
表13各化合物在不同基质中的添加回收率(正确度)和精密度(rsd)
[0140]
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145]
[0146]
[0147]
[0148][0149]
最小定量限(loq)：以最小添加水平作为分析方法最小定量限，各化合物的最小定量限为0.002mg/kg。
[0150]
通过线性曲线测定、三个水平，五个重复的添加回收试验，结果显示在0.001-0.1mg/l浓度范围内，在不同基质中各化合物浓度与其仪器响应呈良好线性关系，相关系数为0.999-1.000。各化合物在9种基质中的添加回收率(正确度)和精密度分别为70.2-110.0％和0.9-16.8％，结果表明实施例1的分析方法符合农作物中农药残留实验准则要求。
[0151]
综上，本发明首次提供了可同时检测10种化合物的液质联用检测方法，该方法具有多种优点，如在0.001-0.1mg/l的浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数达到0.999-1.000；如各化合物检测的正确度可达70.2％-110.0％，精确度可达0.9％-16.8％；如最小检出量可达2
×
10-3
ng；如最小定量限可达0.002mg/kg。该残留分析方法符合我国《农作物中农药残留试验准则》(ny/t 788-2018)要求，可以用于开展农药登记农药残留试验。
[0152]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。