HPLC测定抗病毒药物洛韦类原料药中甲醛含量的方法与流程

本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种hplc测定抗病毒药物洛韦类原料药中甲醛含量的方法。

背景技术：

1、病毒可以感染具有细胞结构的生命体，并利用宿主细胞的代谢系统进行寄生和增殖。常见的病毒感染性疾病包括流感、麻疹、病毒性肝炎、狂犬病、疱疹等，其中疱疹是一类由疱疹病毒科病毒引起的常见疾病，临床主要表现为带状疱疹、单纯疱疹、水痘等。洛韦类抗病毒药物如阿昔洛韦、更昔洛韦、盐酸伐昔洛韦均属于嘌呤核苷类抗病毒药物，它们基于代谢拮抗的原理，竞争性地和dna或rna聚合酶相结合，从而抑制酶的活性，进而干扰病毒核酸的合成，抑制病毒dna的复制，达到抗dna病毒的作用。

2、阿昔洛韦、盐酸伐昔洛韦、更昔洛韦化学结构分别如下：

3、

4、

5、甲醛为合成原料药阿昔洛韦、更昔洛韦、盐酸伐昔洛韦的关键起始物料侧链的降解杂质，因甲醛分子含有基因毒性的警示结构，需对原料药阿昔洛韦、更昔洛韦、盐酸伐昔洛韦中可能存在的甲醛进行研究和控制，以保障人民的用药安全。

6、抗病毒洛韦类药物，如阿昔洛韦、更昔洛韦、盐酸伐昔洛韦等，其中甲醛的含量检测方法未见专利和文献报道。有文献记录的其他化合物的甲醛含量测定方法，均是以磷酸和盐酸等无机酸作为样品溶液衍生化反应所需的酸性条件，磷酸和盐酸等无机酸作为样品溶液衍生化条件所需的酸，容易导致洛韦类原料药阿昔洛韦、更昔洛韦、伐昔洛韦本身降解生成甲醛，导致样品中甲醛含量检测结果不准确，本发明实现了洛韦类药物阿昔洛韦、更昔洛韦、盐酸伐昔洛韦中甲醛含量的准确测定，对于抗病毒洛韦类药物阿昔洛韦、更昔洛韦、盐酸伐昔洛韦原料药的质量控制具有非常重要的现实意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种hplc测定抗病毒药物洛韦类原料药中甲醛含量的方法，以克服上述现有技术中的不足。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种hplc测定抗病毒药物洛韦类原料药中甲醛含量的方法，包括如下步骤：

3、色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以水和乙腈为流动相，等度洗脱，柱温为30℃～40℃，流动相的流速为0.6ml/mi n～1.0ml/mi n，检测波长为360nm；

4、样品溶液的配制：取抗病毒药物洛韦类原料药适量，精密称定，分别加入醋酸溶液、乙腈、衍生试剂，水浴加热，冷却至室温后，用水稀释，制得样品溶液；

5、分离分析：将样品溶液注入高效液相色谱仪，分别计算抗病毒药物洛韦类原料药阿昔洛韦、更昔洛韦、盐酸伐昔洛韦中甲醛含量。

6、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

7、进一步：柱温为35℃。

8、进一步：流动相的流速为0.8ml/mi n。

9、进一步：流动相中水和乙腈的体积比为45:55。

10、进一步：醋酸溶液的浓度为1％～10％。

11、更进一步：醋酸溶液的浓度为2.5％。

12、进一步：衍生试剂为2,4-二硝基苯肼或2,4-二硝基苯肼盐酸盐。

13、进一步：样品溶液中酸溶液为量瓶体积的1/2，乙腈为量瓶体积的1/4，衍生试剂为量瓶体积的1/10。

14、进一步：阿昔洛韦为9-(2-羟乙氧甲基)鸟嘌呤，更昔洛韦为9-[[2-羟基-l-(羟甲基)乙氧基]甲基]鸟嘌呤，伐昔洛韦为l-缬氨酸-2-[6-2-氨基-1,6二氢-9h-嘌呤-9-基]乙基酯及其盐酸盐。

15、进一步：水浴加热温度为70℃，时间为3mi n～7mi n。

16、本发明中所述方法开发过程如下：

17、色谱条件：液相色谱仪waters2695带紫外检测器；

18、电子天平梅特勒-托利多ms105；

19、色谱柱shield rp18 150×4.6mm,3.5μm；

20、流速：0.8ml/min；检测波长：360nm；进样体积：5μl；

21、柱温：35℃；

22、流动相：乙腈：水＝55:45(v/v)，等度洗脱；

23、运行时间：10min；

24、1、供试品溶解剂的选择

25、根据抗病毒洛韦类原料药阿昔洛韦、更昔洛韦和盐酸伐昔洛韦的溶解性，及衍生物的溶解性，分别选择了盐酸溶液、磷酸溶液、酸醋酸溶液和乙腈的混合溶剂作为样品的溶解剂和衍生反应所需的酸性条件。

26、2、对照品稀释剂的选择

27、根据甲醛的性质，选择水作为对照品母液稀释剂。

28、3、2,4-二硝基苯肼衍生反应条件的选择

29、基于对2,4-二硝基苯肼与甲醛衍生反应机制，可以看出此衍生反应需要在酸性和加热的条件下进行，对衍生试剂的用量、醋酸的用量、衍生反应温度，对这三个关键的参数进行了研究。

30、3.1试验过程的对照品及样品溶液配制过程如下：

31、样品溶液：取阿昔洛韦样品50mg，精密称定，置20ml的棕色容量瓶中，加衍生试剂(0.2mg/ml)适量，乙腈5ml，水1ml和醋酸溶液10ml于70℃水浴5min，取出冷却至室温后，用水稀释至刻度，混匀；

32、甲醛对照品储备液：称取37％的甲醛溶液270mg，精密称定，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密移取1.0ml至100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀(10ug/ml)；

33、甲醛对照溶液：精密移取甲醛对照品贮备溶液1.0ml至20ml量瓶中，加0.2mg/m l的衍生试剂适量，乙腈5m l和醋酸溶液10m l于70℃水浴5mi n，取出冷却至室温，用水稀释至刻度，混匀(0.5ug/m l)；

34、3.2试验结果和结论

35、甲醛衍生条件摸索结果汇总1

36、

37、

38、结论：

39、①使用盐酸溶液、磷酸溶液作为衍生化条件的酸性催化剂时，阿昔洛韦本身会降解生成甲醛；

40、②醋酸的浓度从2.5％、5％、10％，用量分别为10ml，甲醛对照品衍生物峰面积有随酸的用量增加减少的趋势，2.5％的醋酸浓度较合适，并将对醋酸的用量进一步考察；

41、③使用衍生试剂2ml和3ml甲醛对照品衍生物峰面积相似，使用3ml衍生试剂时，甲醛对照品衍生物峰面积略大，将对衍生试剂的用量进一步考察；

42、④加热条件60℃反应20min与70℃反应3min、5min、7mn,甲醛对照品衍生物峰面积近似，因反应20min反应时间较长，不利于检测效率，故选择反应时间较短且有耐受性的70℃反应5min作为衍生反应的温度条件。

43、根据上述的研究结果，对醋酸的用量和衍生试剂的用量做了进一步研究，试验结果汇总2。

44、甲醛衍生条件摸索结果汇总2

45、

46、

47、结论：

48、①醋酸用量为浓度2.5％醋酸10ml时，甲醛对照品溶液峰面积最大，反应条件最佳，而且此条件下加样回收率好，故选择酸的用量为2.5％醋酸10ml；

49、②使用衍生试剂用量加大时，空白峰面积也增大，衍生试剂用量为0.2mg/ml 2ml时，甲醛对照品可衍生充分，故选择生试剂用量为0.2mg/ml2,4-二硝基苯肼2ml。

50、4.确定的分析方法条件

51、4.1色谱条件

52、建立了适宜的色谱条件，以保证样品溶液中的衍生物峰有效分离，以保证方法性能符合专属性、准确度、重复性和定量限等的要求，色谱条件如下表：

53、仪器：高效液相色谱仪带紫外检测器

54、色谱柱：watersshield rp 18 150×4.6mm，3.5μm；流速：0.8ml/min；检测波长：360nm；进样体积：5μl；

55、柱温：35℃；

56、流动相：乙腈：水＝55:45(v/v)，等度洗脱；

57、运行时间：10mi n；

58、4.2溶液配制

59、1)衍生试剂：称取约20mg的2,4-二硝基苯肼盐酸盐(dnph)置100m l棕色量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，混匀(0.2mg/ml)；

60、2)2.5％的醋酸溶液：移取2.5ml冰醋酸于100ml量瓶中，用水溶稀释至刻度，摇匀；

61、3)空白溶液：分别移取2ml衍生试剂(0.2mg/ml)、5ml乙腈、1ml水和2.5％的醋酸溶液10ml，置20ml的棕色容量瓶中，于70℃水浴5mi n，取出冷却至室温后，用水稀释至刻度，混匀；

62、4)样品溶液：取阿昔洛韦样品50mg，精密称定，置20ml的棕色容量瓶中，分别加衍生试剂(0.2mg/ml)2ml、乙腈5m l、水1ml和2.5％的醋酸溶液10ml，于70℃水浴加热5mi n，取出冷却至室温后，用水稀释至刻度，混匀；

63、5)甲醛对照品储备液：称取37％的甲醛溶液270mg，精密称定，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密移取1.0ml至100m l量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀(10ug/ml)；

64、6)甲醛对照溶液：精密移取甲醛对照品贮备溶液1.0ml至20m l量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀0.5ug/ml)，精密移取该溶液1ml、衍生试剂2ml、乙腈5ml、2.5％醋酸溶液10ml至20ml棕色量瓶中，在70℃水浴加热5mi n，冷却至室温后，用水稀释至刻度，摇匀即得。

65、4.3进样程序

66、分别进样空白溶液、甲醛对照品溶液和样品溶液。

67、4.4计算

68、按外标法计算样品中甲醛的含量。

69、对上述分析方法进行了方法学验证：

70、1.试剂和样品、对照品：

71、试剂：乙腈：色谱纯；水：纯化水；乙酸：分析纯；2,4-二硝基苯肼盐酸盐：分析纯

72、37％甲醛对照品溶液、阿昔洛韦样品、更昔洛韦、盐酸伐昔洛韦样品。

73、2.仪器设备

74、十万分之一电子天平梅特勒-托利多ms105d

75、液相色谱仪agilent 1260带紫外检测器

76、3.色谱条件：

77、色谱柱：watersshield rp 18 150×4.6mm，3.5μm

78、流速：0.8ml/min；检测波长：360nm；进样体积：5μl；

79、柱温：35℃；

80、流动相：乙腈：水＝55:45(v/v)，等度洗脱；

81、运行时间：10min；

82、4.溶液配制

83、衍生试剂：称取2,4-二硝基苯肼盐酸盐约20mg，置100ml棕色量瓶中，精密称定，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀即得(临用前配制)；

84、2.5％醋酸溶液：精密移取5ml冰醋酸至200ml量瓶中，用水稀释至刻度；

85、甲醛贮备液1：称取37％甲醛溶液270mg于100ml量瓶中，精密称定，用水溶解并稀释到刻度，混匀(1mg/ml)；

86、甲醛贮备液2：精密移取1.0ml甲醛贮备液于100ml量瓶中，精密称定，用水溶解并稀释到刻度，混匀(10μg/ml)；

87、空白溶液：精密移取衍生试剂2ml、乙腈5ml、水1ml、2.5％醋酸溶液10ml至20ml棕色量瓶中，在70℃水浴加热5min，冷却至室温后，用水稀释至刻度，混匀；

88、对照品溶液：精密移取衍生试剂2ml、乙腈5ml、1ml甲醛贮备液2、2.5％醋酸溶液10ml至20ml棕色量瓶中，在70℃水浴加热5min，冷却至室温后，用水稀释至刻度，摇匀即得；

89、供试品溶液配制：称取本品约50mg，置20ml棕色量瓶中，精密称定，分别加入2.5％醋酸溶液10ml、乙腈5ml、衍生试剂2ml、水1ml溶解，在70℃水浴加热5min，冷却至室温后，用水稀释至刻度，摇匀即得；

90、专属性考察溶液：称取阿昔洛韦样品约50mg，置20ml棕色量瓶中，精密称定，加衍生试剂2ml、乙腈5ml、1.0ml甲醛贮备液2、2.5％醋酸溶液10ml至20ml量瓶中，在70℃水浴加热5min，冷却至室温后，用水稀释至刻度，混匀；

91、100％加样溶液：称取阿昔洛韦样品约50mg，置不同的20ml棕色量瓶中，精密称定，分别加衍生试剂2ml、乙腈5ml、1.0ml甲醛贮备液2、2.5％醋酸溶液10ml至20ml量瓶中，在70℃水浴加热5min，冷却至室温后，用水稀释至刻度，混匀，平行配制6份；

92、验证结果如下：

93、1、专属性

94、取衍生空白、甲醛对照品、专属性考察溶液按上述色谱条件进入色谱系统，结果如下:

95、 组分名称 保留时间 分离度 2,4二硝基苯肼 3.119 / 甲醛衍生物 4.454 7.05 其它杂质1 5.449 4.07

96、结论：衍生空白溶液有干扰，甲醛衍生物峰与相邻峰的分离度最小为4.07，(中国药典要求不小于1.5)，方法专属性符合要求；

97、2、系统适用性

98、取甲醛对照品溶液(浓度0.1665g/ml)按上述条件连续进样6针，按上述色谱条件进入色谱系统，结果如下:

99、

100、结论：对照品溶液重复进样6次，甲醛衍生物峰面积rsd为0.4％(中国药典要求不大于10％),符合要求。

101、3、精密度(重复性)

102、取6份100％加样回收样品按上述色谱条件进入色谱系统，结果如下:

103、

104、结论：6份阿昔洛韦100％加样回收样品，回收率间的rsd为1.15％，(中国药典要求不大于10％),精密度符合要求；

105、4、线性和范围

106、取甲醛对照品线性浓度范围在0.0165μg/ml～0.33μg/ml的溶液，按上述色谱条件进入色谱系统，结果如下：

107、

108、线性图见附图6；

109、结论：甲醛对照品在0.0165～0.33μg/ml浓度范围内，线性相关系数r2为1.0000(中国药典要求不小于0.98),线性符合要求；

110、5、定量限和检测限

111、取甲醛对照品0.0167μg/ml和0.005μg/ml的溶液，按上述色谱条件进入色谱系统，结果如下：

112、 名称 定量限 检测限 浓度(ug/ml) 0.0167 0.005 限度(ppm) 6.7 2 信噪比 16 5

113、结论：分析方法检测限为0.005μg/ml(2ppm)，该发明的分析方法灵敏度高；

114、6、准确度(甲醛的加样回收率)

115、分别取阿昔洛韦样品(浓度2.5mg/ml)，甲醛加标浓度分别为50％(0.083μg/ml)、100％(0.167μg/ml)、200％(0.250μg/ml)三个浓度水平9份加样回收，按上述色谱条件进入色谱系统，9份样品中对映异构体杂质回收率结果如下：

116、

117、结论：50％、100％、200％三个浓度水平9份加样回收率应分别为：88.25％、101.97％、88.77％(中国药典要求85％～108％)；回收率间的总rsd为7.3％，不超过10.0％，回收率符合要求，准确度好。

118、本发明的有益效果是：

119、以2,4-二硝基苯肼为衍生剂，以醋酸为主要酸的酸性条件下进行衍生反应制得的样品溶液，以十八烷基硅烷(c18)键合硅胶为固定相，以乙腈和水作为流动相，等度洗脱，可以在同一色谱条件下进行快速高效、准确的测定抗病毒药物洛韦类原料药阿昔洛韦、更昔洛韦、盐酸伐昔洛韦中甲醛的含量，以保障阿昔洛韦、更昔洛韦、盐酸伐昔洛韦原料药的质量，该检测方法专属性强、系统适用性强、精密度高、线性符合要求、灵敏度高、准确度高、操作方便，可有效控制药品的质量。