用于检测毒素的侧向层析试纸条、制备方法和使用方法

1.本技术涉及毒素检测技术领域，尤其涉及一种用于检测毒素的侧向层析试纸条、制备方法和使用方法。


背景技术：

2.毒素通常是谷物、饲料在收获、转运和存储的过程中由于处理不当由细菌产生的二级代谢产物，人或动物误食了代谢产物可能导致疾病或者死亡，因此，对谷物饲料中霉菌毒素的检测具有重要意义。目前常用的检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱串联法和气相色谱-质谱串联法等，尽管这些检测方法能够对毒素进行精确检测，但是对于检测样品的预处理繁琐且仪器成本高昂，使得这些方法不能用于现场即时检测。
3.侧向流免疫层析试纸条具有操作简单、成本低、检测时间短和方便携带等优点，是现场即时检测的重要方法之一，然而传统的侧向层析试纸条存在检测灵敏度不高等缺点，而表面增强拉曼散射sers技术具有灵敏度高、不受水溶液干扰、对样品无损伤、光谱半峰宽窄和易操作等优点，所以将sers技术与侧向流免疫层析相结合为现场高灵敏度多元检测霉菌毒素提供了新方法。
4.但现有的基于金纳米颗粒的sers侧向层析试纸条对检测信号的增强效果不大，并且特别容易受检测环境影响，稳定性极差，因此亟需开发一种稳定性强且能增强检测信号强度的sers侧向层析试纸条。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本技术的目的在于提出一种用于检测毒素的侧向层析试纸条、制备方法和使用方法。
6.基于上述目的，本技术第一方面提供了一种用于检测毒素的侧向层析试纸条，包括：底板，所述底板上沿长度方向依次设有样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫，所述层析膜上设有检测线和质控线；所述检测线上附着有毒素标志物抗原；所述质控线上附着有二抗抗体；所述结合垫上附着有与拉曼探针连接的检测抗体，所述拉曼探针包括结合的拉曼信标分子和二氧化硅包金纳米粒子。
7.进一步地，所述检测线上附着有至少两种所述毒素标志物抗原，所述结合垫上附着有至少两种与所述毒素标志物抗原相对应的所述检测抗体，所述质控线上附着有至少两种与所述检测抗体相对应的所述二抗抗体。
8.进一步地，所述样品垫和所述结合垫的厚度均为0.3mm-0.5mm，所述样品垫和所述结合垫的总长度为15mm-20mm；所述层析膜的长度为22mm-30mm，所述检测线与所述质控线的间距为6mm-8mm；所述吸收垫的厚度为0.5mm-0.8mm，长度为25mm-30mm；所述底板的长度为75mm-90mm，厚度为3mm-5mm。
9.本技术的第二方面，提供了一种第一方面所述的用于检测毒素的侧向层析试纸条的制备方法，包括：制备拉曼探针；将所述拉曼探针与检测抗体连接；将与所述拉曼探针连
接的所述检测抗体附着在结合垫上，将毒素标志物抗原附着在层析膜的检测线上，将二抗抗体附着在所述层析膜的质控线上；将样品垫、所述结合垫、所述层析膜和吸收垫设置在底板上得到所述侧向层析试纸条。
10.进一步地，所述制备拉曼探针，包括：将结合有拉曼信标分子的胶体金进行离心操作得到第一沉淀，向所述第一沉淀中加入水和异丙醇进行搅拌得到第一溶液；向所述第一溶液中加入氨水，调节ph值至预设值后，逐步加入硅酸四乙酯异丙醇溶液，进行搅拌反应得到第二溶液；将所述第二溶液冷藏存放预设时间后进行离心操作得到第二沉淀，将所述第二沉淀洗涤后重悬在水中得到含有所述拉曼探针的第三溶液。
11.进一步地，所述拉曼信标分子包括尼尔蓝a、对巯基苯甲酸、亚甲基蓝、5,5-二硫代氨基甲酸、罗丹明6g、对氨基苯硫酚、孔雀石绿、4-巯基吡啶、对巯基苯胺或对氨基苯硫酚中的一种或多种。
12.进一步地，所述向所述第一溶液中加入氨水，调节ph值至预设值后，逐步加入硅酸四乙酯异丙醇溶液，进行搅拌反应得到第二溶液，包括：向所述第一溶液中加入氨水，调节ph值至10后，在5h内逐步加入硅酸四乙酯异丙醇溶液，常温进行搅拌反应3h得到第二溶液。
13.进一步地，所述将所述第二溶液冷藏存放预设时间后进行离心操作得到第二沉淀，包括：将所述第二溶液在3℃-5℃存放至少12h后进行离心操作得到第二沉淀。
14.进一步地，所述将所述拉曼探针与检测抗体连接，包括：将3-(三乙氧基硅丙基氨甲酰)丁酸乙醇溶液加入到所述第三溶液中进行摇晃反应，离心后得到第三沉淀；将所述第三沉淀洗涤后重悬在水中得到第四溶液，向所述第四溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与磺化n-羟基琥珀酰亚胺进行活化，再加入检测抗体进行孵育反应，离心后得到与所述拉曼探针连接的所述检测抗体。
15.本技术的第三方面，提供了一种第一方面所述的用于检测毒素的侧向层析试纸条的使用方法，包括：将检测样品滴入所述侧向层析试纸条的所述样品垫上；经过预设反应时间后，根据所述检测线和所述质控线的显色情况得到检测结果；测量所述检测线的拉曼信号强度，根据所述拉曼信号强度确定毒素浓度。
16.从上面所述可以看出，本技术提供的用于检测毒素的侧向层析试纸条、制备方法和使用方法，通过设置底板承载样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫；设置样品垫用于吸收检测样品；结合垫附着有检测抗体，设置结合垫用于流过样品垫的检测样品与检测抗体相互作用，并流向层析膜；层析膜上依次设有检测线和质控线，检测线上附着有毒素标志物抗原，用于与检测抗体结合显色，与检测样品中的毒素形成竞争关系；质控线上附着有二抗抗体，用于与检测抗体结合显色，验证检测是否有效；设置吸收垫利用毛细作用将检测液体吸过层析膜并收集处理后的废液，这样就可以使用更多量的检测样品，从而提高测试灵敏度；检测抗体与拉曼探针结合，可以提高检测信号的强度和灵敏度，拉曼探针包括结合的拉曼信标分子和二氧化硅包金纳米粒子，拉曼信标分子用于拉曼信号检测，二氧化硅包金纳米粒子能够增强核壳间隙处的电磁场强度，进而提高拉曼信号强度，而且二氧化硅壳层化学性能稳定，具有抗腐蚀功能，可以保护金纳米粒子，不受检测环境的干扰，减少团聚的可能性，具有良好的生物相容性，进而可以提高检测灵敏度、降低测量极限值；该用于检测毒素的侧向层析试纸条、制备方法和使用方法，拉曼探针稳定性好，拉曼信号检测强度高，试纸条检测灵敏度高，可以在复杂环境下检测多种霉菌毒素，为谷物饲料安全提供保障。
附图说明
17.为了更清楚地说明本技术或相关技术中的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为本技术实施例中一种用于检测毒素的侧向层析试纸条的结构示意图；
19.图2为本技术实施例中经过冷藏存放12h后制备的拉曼探针的电镜结构示意图；
20.图3为本技术实施例中经过冷藏存放8h后制备的拉曼探针的电镜结构示意图；
21.图4为本技术实施例中经过冷藏存放4h后制备的拉曼探针的电镜结构示意图；
22.图5为本技术实施例中未经过冷藏存放制备的拉曼探针的电镜结构示意图；
23.图6为本技术实施例中对不同浓度黄曲霉毒素b1(afb1)和赭曲霉毒素a(ota)进行检测的拉曼光谱图；
24.图7为本技术实施例中拉曼信号强度与afb1浓度的关系示意图；
25.图8为本技术实施例中拉曼信号强度与ota浓度的关系示意图。
26.附图标记：1、底板；2、样品垫；3、结合垫；4、层析膜；4-1、检测线；4-2、质控线；5、吸收垫。
具体实施方式
27.为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本公开进一步详细说明。
28.需要说明的是，除非另外定义，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
29.毒素通常是谷物、饲料在收获、转运和存储的过程中由于处理不当由细菌产生的二级代谢产物，人或动物误食了代谢产物可能导致疾病或者死亡，因此，对谷物饲料中霉菌毒素的检测具有重要意义。目前常用的检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱串联法和气相色谱-质谱串联法等，尽管这些检测方法能够对毒素进行精确检测，但是对于检测样品的预处理繁琐且仪器成本高昂，使得这些方法不能用于现场即时检测。
30.侧向流免疫层析试纸条具有操作简单、成本低、检测时间短和方便携带等优点，是现场即时检测的重要方法之一，然而传统的侧向层析试纸条存在检测灵敏度不高等缺点，而表面增强拉曼散射sers技术是以金属纳米结构介导的信号增强效应，可实现高达10-14倍的单分子拉曼信号增强，具有灵敏度高、不受水溶液干扰、对样品无损伤、光谱半峰宽较窄和易操作等优点，这使得sers技术在食品安全、医疗诊断和环境检测等领域有广泛的应用，所以将sers技术与侧向流免疫层析相结合为现场高灵敏度多元检测霉菌毒素提供了新方法。
31.但现有的基于金纳米颗粒的sers侧向层析试纸条对检测信号的增强效果不大，并且特别容易受检测环境影响，稳定性极差，金纳米粒子由于具有较高的表面能，对于外来干扰物比较敏感，使其很容易发生团聚和沉淀，因此在检测中其稳定性差，从而限制了它在复杂环境下的应用，因此亟需开发一种稳定性强且能增强检测信号强度的sers侧向层析试纸
条。
32.以下，通过具体的实施例并结合图1至图8来详细说明本技术的技术方案。
33.本技术的一些实施例中，提供了一种用于检测毒素的侧向层析试纸条，如图1所示，包括：底板1，所述底板1上沿长度方向依次设有样品垫2、结合垫3、层析膜4和吸收垫5，所述层析膜4上设有检测线4-1和质控线4-2；所述检测线4-1上附着有毒素标志物抗原；所述质控线4-2上附着有二抗抗体；所述结合垫3上附着有与拉曼探针连接的检测抗体，所述拉曼探针包括结合的拉曼信标分子和二氧化硅包金纳米粒子。
34.通过设置底板1承载样品垫2、结合垫3、层析膜4和吸收垫5，底板1的材料可以为聚氯乙烯树脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚乙烯等，具体不做限定。
35.设置样品垫2用于吸收检测样品，可以分离过滤检测样品中的杂质，对样品进行前处理，平衡检测样品的ph和调整盐离子强度等，使检测样品在层析过程中保持一定的均一性和可控性，样品垫2的材料可以为玻璃纤维纸，具体不做限定。
36.结合垫3附着有检测抗体，设置结合垫3用于流过样品垫2的检测样品与检测抗体相互作用，并流向层析膜4，检测抗体例如为afb1检测抗体等，用于与毒素相结合，结合垫3的材料可以为玻璃纤维纸等，具体不做限定。
37.层析膜4的材料可以为硝酸纤维素，层析膜4的孔径可以为2μm-8μm，具体不做限定，层析膜4上依次设有检测线4-1和质控线4-2，检测线4-1上附着有毒素标志物抗原，用于与检测抗体结合显色，与检测样品中的毒素形成竞争关系；质控线4-2上附着有二抗抗体，用于与检测抗体结合显色，验证检测是否有效；毒素标志物抗原例如为毒素标志物与牛血清白蛋白结合的半抗原，二抗抗体例如为能与afb1检测抗体结合的抗体，具体不做限定。
38.吸收垫5的材料可以为吸水纸，具体不做限定，设置吸收垫5利用毛细作用将检测液体吸过层析膜4并收集处理后的废液，这样就可以使用更多量的检测样品，从而提高测试灵敏度。
39.检测抗体与拉曼探针结合，可以提高检测信号的强度和灵敏度，拉曼探针包括结合的拉曼信标分子和二氧化硅包金纳米粒子，拉曼信标分子用于拉曼信号检测，为定量分析毒素浓度提供基础，二氧化硅包金纳米粒子即au@sio2核壳颗粒，能够增强核壳间隙处的电磁场强度，进而提高拉曼信号强度，而且二氧化硅壳层化学性能稳定，具有抗腐蚀功能，可以保护金纳米粒子，不受检测环境的干扰，减少团聚的可能性，具有良好的生物相容性，进而可以提高检测灵敏度、降低测量极限值。
40.该用于检测毒素的侧向层析试纸条，拉曼探针稳定性好，拉曼信号检测强度高，试纸条检测灵敏度高，可以在复杂环境下检测多种霉菌毒素，为谷物饲料安全提供保障，通过检测测试后的侧向层析试纸条的拉曼信号强度，还可以定量分析毒素浓度，为精确判断提供基础。
41.在一些实施例中，所述检测线4-1上附着有至少两种所述毒素标志物抗原，所述结合垫3上附着有至少两种与所述毒素标志物抗原相对应的所述检测抗体，所述质控线4-2上附着有至少两种与所述检测抗体相对应的所述二抗抗体。
42.通过在检测线4-1上设置至少两种毒素标志物抗原，在质控线4-2上设置至少两种二抗抗体，在结合垫3上设置至少两种检测抗体，可以在一个侧向层析试纸条上同时检测多种毒素，每一套毒素标志物抗原、二抗抗体和检测抗体对应检测一种毒素，这样可以提高现
场检测效率，也提高了资源利用率；对于每种检测抗体可以结合不同的拉曼信标分子，为定量分析不同毒素浓度提供基础。
43.在一些实施例中，所述样品垫2和所述结合垫3的厚度均为0.3mm-0.5mm，所述样品垫2和所述结合垫3的总长度为15mm-20mm；所述层析膜4的长度为22mm-30mm，所述检测线4-1与所述质控线4-2的间距为6mm-8mm；所述吸收垫5的厚度为0.5mm-0.8mm，长度为25mm-30mm；所述底板1的长度为75mm-90mm，厚度为3mm-5mm；样品垫2、结合垫3、层析膜4和吸收垫5之间的重叠部分可以为2mm-4mm，具体不做限定。
44.在一些实施例中，提供了一种用于检测毒素的侧向层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
45.s1、制备拉曼探针。
46.s2、将所述拉曼探针与检测抗体连接。
47.s3、将与所述拉曼探针连接的所述检测抗体附着在结合垫3上，将毒素标志物抗原附着在层析膜4的检测线4-1上，将二抗抗体附着在所述层析膜4的质控线4-2上。
48.s4、将样品垫2、所述结合垫3、所述层析膜4和吸收垫5设置在底板1上得到所述侧向层析试纸条。
49.在一些实施例中，所述制备拉曼探针，包括：
50.s101、将结合有拉曼信标分子的胶体金进行离心操作得到第一沉淀，向所述第一沉淀中加入水和异丙醇进行搅拌得到第一溶液。
51.拉曼信标分子可以包括尼尔蓝a、对巯基苯甲酸、亚甲基蓝、5,5-二硫代氨基甲酸、罗丹明6g、对氨基苯硫酚、孔雀石绿、4-巯基吡啶、对巯基苯胺或对氨基苯硫酚中的一种或多种；胶体金是一种广泛用于侧向层析试纸条的偶联物，因为它能产生强烈的颜色，易于偶联，并且它的质量稳定。
52.结合有拉曼信标分子的胶体金可以通过向胶体金中滴加拉曼信标分子反应20min-30min，拉曼信标分子通过物理吸附或者共价连接在金属纳米颗粒表面。
53.步骤s101可以取20ml尺寸在45nm-60nm的结合有拉曼信标分子的胶体金，以4000转/秒进行离心，得到结合有拉曼信标分子的胶体金的第一沉淀，收取第一沉淀于离心管中，以去掉上浮过量的拉曼信标分子，然后向离心管加入20ml去离子水和100ml异丙醇溶液进行搅拌混合，制造有机体系，方便后续成壳。
54.s102、向所述第一溶液中加入氨水，调节ph值至预设值后，逐步加入硅酸四乙酯异丙醇溶液，进行搅拌反应得到第二溶液。
55.预设值例如为9.5-10.5，具体不做限定。
56.步骤s102可以向第一溶液中加入2.5ml质量浓度为30％的氨水，调节ph值至10后，在5h内逐步加入2ml浓度为10mm的硅酸四乙酯异丙醇溶液，例如每隔1h加入0.4ml硅酸四乙酯异丙醇溶液，通过氨水水解硅酸四乙酯，常温进行搅拌反应3h，使二氧化硅包裹纳米颗粒金成壳，得到第二溶液，第二溶液中包含有所述拉曼探针，即相互结合的二氧化硅包金核壳结构纳米粒子与拉曼信标分子，其中拉曼信标分子通过物理吸附或者共价连接在纳米金颗粒表面或者核壳结构纳米颗粒的间隙中。
57.s103、将所述第二溶液冷藏存放预设时间后进行离心操作得到第二沉淀，将所述第二沉淀洗涤后重悬在水中得到含有所述拉曼探针的第三溶液。
58.冷藏温度例如为3℃、4℃或5℃，预设时间例如为12h、16h、20h或24h等，具体不做限定。
59.步骤s103可以将第二溶液在3℃-5℃存放至少12h后进行离心操作得到第二沉淀，这样可以使拉曼探针结构更稳定，将第二沉淀用乙醇或蒸馏水进行洗涤，去除杂质，并把第二沉淀重悬在20ml的去离子水中保存，得到含有更为纯净、分散均一、结构稳定的拉曼探针的第三溶液。
60.在一些实施例中，所述将所述拉曼探针与检测抗体连接，包括：
61.s201、将3-(三乙氧基硅丙基氨甲酰)丁酸乙醇溶液加入到所述第三溶液中进行摇晃反应，离心后得到第三沉淀。
62.步骤s201可以将4.5ml浓度为4.5mm的3-(三乙氧基硅丙基氨甲酰)丁酸乙醇溶液加入到8ml第三溶液中，使酸酐水解出羧基，然后加入32ml乙醇溶液，室温摇晃反应2h，使羧基与拉曼探针连接，离心后得到第三沉淀，第三沉淀包括羧基修饰后的拉曼探针。
63.s202、将所述第三沉淀洗涤后重悬在水中得到第四溶液，向所述第四溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与磺化n-羟基琥珀酰亚胺进行活化，再加入检测抗体进行孵育反应，离心后得到与所述拉曼探针连接的所述检测抗体。
64.步骤s202可以用乙醇溶液洗涤4次第三沉淀，去除杂质，然后重悬在4ml去离子水中得到第四溶液，向100μl第四溶液加入5mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、890μl浓度为0.1m的磷酸盐缓冲液和10μl浓度为0.5mm的磺化n-羟基琥珀酰亚胺水溶液，室温混匀2h，对羧基进行活化，可以用磷酸盐缓冲液对活化后的拉曼探针洗涤三次，去除杂质，然后重悬到200μl磷酸盐缓冲液中，再加入检测抗体与拉曼探针进行孵育反应，离心后得到与拉曼探针连接的检测抗体。
65.本技术的一些实施例中提供了一种用于检测毒素的侧向层析试纸条的使用方法，包括：
66.a、将检测样品滴入所述侧向层析试纸条的所述样品垫2上。
67.检测样品也可以先与检测抗体在容器中反应后再滴入样品垫2，这样方便检测样品中的毒素与检测抗体充分作用，检测结果更准确。
68.b、经过预设反应时间后，根据所述检测线4-1和所述质控线4-2的显色情况得到检测结果。
69.预设反应时间例如为1min，具体不做限定。
70.该侧向层析试纸条属于竞争法检测试纸条，当所述检测线4-1和所述质控线4-2均显色且显色程度相同时，则检测结果为阴性；当所述检测线4-1的显色程度弱于所述质控线4-2的显色程度时，则检测结果为阳性，检测线4-1的颜色越浅，说明毒素的浓度越高；当所述质控线4-2不显色时，则检测结果为无效。
71.c、测量所述检测线4-1的拉曼信号强度，根据所述拉曼信号强度确定毒素浓度。
72.对于检测结果为阳性的侧向层析试纸条，可以进一步测量其检测线4-1的拉曼信号强度，根据预先获取的拉曼信号强度和浓度关系曲线可以确定实际检测到毒素浓度，实现毒素的定量分析，为谷物饲料安全提供保障。
73.例如制作多个可以同时检测黄曲霉毒素b1(afb1)和赭曲霉毒素a(ota)的侧向层析试纸条，每个侧向层析试纸条的检测线4-1上附着有afb1毒素标志物抗原和ota毒素标志物
抗原，结合垫3上附着有afb1检测抗体和ota检测抗体，质控线4-2上附着afb1二抗抗体和ota二抗抗体。
74.使用该侧向层析试纸条测试不同浓度的afb1和ota溶液样品，并测量相应的拉曼信号强度，如图6的拉曼光谱图所示，拉曼光谱存在afb1和ota的两个特征峰，因为该侧向层析试纸条属于竞争法检测试纸条，毒素浓度含量越高，相应的拉曼强度越低，根据不同毒素浓度和相应的拉曼强度可以得到其对应关系，如图7所示为拉曼信号强度-afb1浓度关系曲线图，如图8所示为拉曼信号强度-ota浓度关系曲线图，两种关系曲线图可以作为参考基础，在检测实际样品的拉曼信号强度后，可以对应关系曲线图确定实际样品毒素浓度，实现定量分析。
75.实施例1
76.通过步骤s101和步骤s102得到第二溶液，将第二溶液在4℃存放12h后进行离心操作得到第二沉淀，将第二沉淀用蒸馏水洗涤后重悬在水中得到第三溶液。
77.实施例2
78.通过步骤s101和步骤s102得到第二溶液，将第二溶液在4℃存放8h后进行离心操作得到第二沉淀，将第二沉淀用蒸馏水洗涤后重悬在水中得到第三溶液。
79.实施例3
80.通过步骤s101和步骤s102得到第二溶液，将第二溶液在4℃存放4h后进行离心操作得到第二沉淀，将第二沉淀用蒸馏水洗涤后重悬在水中得到第三溶液。
81.实施例4
82.通过步骤s101和步骤s102得到第二溶液，将第二溶液直接进行离心操作得到第二沉淀，将第二沉淀用蒸馏水洗涤后重悬在水中得到第三溶液。
83.实施例1-实施例4通过改变对拉曼探针的冷藏存放时间制备不同的第三溶液，对每个实施例的第三溶液进行扫描电镜观察得到相应的电镜图，实施例1的第三溶液的电镜图如图2所示，即经过冷藏存放12h制备的拉曼探针的电镜图，可以看出拉曼探针分散均一，sio2壳的厚度约6nm，未出现脱离现象，结构稳定性好；实施例2的第三溶液的电镜图如图3所示，即经过冷藏存放8h制备的拉曼探针的电镜图，可以看出拉曼探针分散有部分团聚现象，sio2壳也出现少量脱离现象；实施例3的第三溶液的电镜图如图4所示，即经过冷藏存放4h制备的拉曼探针的电镜图，可以看出拉曼探针分散相对较差，有较多团聚现象，sio2壳也脱离较多，稳定性差；实施例4的第三溶液的电镜图如图5所示，即未经过冷藏存放制备的拉曼探针的电镜图，可以看出拉曼探针的团聚现象较为严重，并且大量的sio2壳出现脱离现象；说明随着对拉曼探针冷藏存放的时间延长，二氧化硅包金纳米粒子的结构稳定性逐渐加强，冷藏存放12h以上的拉曼探针分散均一，抗干扰能力更强。
84.所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本公开实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
85.本公开实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本公开实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。