用于早期诊断和预测糖尿病视网膜病变进展的糖代谢组学相关生物标记物及其应用

1.本发明涉及生物标记物领域，特别是涉及用于早期诊断和预测糖尿病视网膜病变进展的糖代谢组学相关生物标记物及其应用。


背景技术：

2.糖尿病视网膜病变(dr)是糖尿病(dm)的一种微血管眼部并发症，是导致劳动年龄人群（20-65岁）视力损害和不可逆转失明的主要原因。dr在全球糖尿病人群中的发病率为34.6%。dr的终末期为pdr，存在新生血管、玻璃体出血及视网膜前出血的特征，严重威胁和损害患者的视功能。
3.目前，血糖和糖化血红蛋白的水平仍是影响dr进展的重要危险因素，结合影像学指标，临床上常用来诊断dr和预测dr的进展，但这种方法存在如下的缺点： (1) 缺乏 dr 早期筛查的便利手段：研究表明，从发现糖尿病开始的 10 年期间，有 3/4的人群进展为 dr。对 dr 的早期诊断主要依赖价格昂贵的影像学检查：如眼底照相、眼底荧光造影、oct 等，这些检查需要患者前往医疗机构筛查，不能达到便利实时监控 dr 病情进展的目的。(2) 缺乏反映 dr 进展的特异性代谢标记物：血糖和糖化血红蛋白是影响 dr 发展的危险因素，但控制其水平后，dr 仍然会进展。随着糖代谢组学的深入研究，发现 dr的发生及发展不仅与葡萄糖水平有关，还与其他糖相关代谢物有关，如乳酸、果糖等。因此，加强对糖代谢组学标志物的监控，有利于 dr 的早期诊断和延缓进展。(3)目前对于上述两种生化指标都采用有创的方式进行监测，会给患者造成一定的痛苦。因此探索发现能够无创监测并早期诊断和预测dr的生物标记物很有必要。
4.泪液，作为一种新型的生物体液，成为最近研究的热点。从组成上讲，泪液与血液成分相似但比血液成分简单；从代谢物质的联系上讲，在dr患者中，泪液葡萄糖浓度与血糖浓度呈现确定的线性正相关，但其相关程度不高。提示虽然血泪液中的代谢物质存在一定的关联，但还存在其他物质参与dr的发生及发展。因此，本发明针对泪液研究了一种或几种无创的、能更好的诊断和预测dr进展的生物标记物。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供用于早期诊断和预测糖尿病视网膜病变进展的糖代谢组学相关生物标记物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用乳酸或者乳酸和葡萄糖、果糖、半乳糖及甘露糖组合使用时，可以高灵敏度和特异性的区分增殖性与非增殖性糖尿病视网膜病变。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：本发明提供用于早期诊断和预测糖尿病视网膜病变进展的糖代谢组学相关生物标记物，所述糖代谢组学生物标记物包括乳酸，或者乳酸与至少一种单糖组合。
7.优选的是，所述单糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖和甘露糖。
8.本发明还提供糖代谢相关生物标记物在制备用于早期诊断和预测糖尿病视网膜病变进展的试剂或者试剂盒中的应用，所述糖代谢组学相关生物标记物包括如下任一项：（1）乳酸；（2）乳酸和至少一种单糖组合。
9.本发明还提供检测糖代谢组学相关生物标记物的试剂在制备用于早期诊断和与预测糖尿病视网膜病变进展的试剂或试剂盒中的应用，所述糖代谢组学相关生物标记物包括如下任一项：（1）乳酸；（2）乳酸和至少一种单糖组合。
10.优选的是，所述早期诊断和与预测糖尿病视网膜病变进展的试剂或试剂盒包括基于uplc/ms检测生物样品中糖代谢组学相关生物标记物的试剂或试剂盒。
11.优选的是，所述生物样品包括泪液。
12.优选的是，所述生物样品中至少一种所述糖代谢组学相关生物标记物的含量，与血液中葡萄糖的含量呈线性正相关。
13.优选的是，所述单糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖和甘露糖。
14.优选的是，所述糖尿病视网膜病变包括增殖性糖尿病视网膜病变和非增殖性糖尿病视网膜病变。
15.本发明公开了以下技术效果：本发明以泪液为生物样品筛选出用于早期诊断和预测糖尿病视网膜病变的糖代谢组学相关生物标记物，通过实验验证发现，泪液中生物标记物乳酸或者乳酸与单糖（葡萄糖、果糖、半乳糖和甘露糖）组合时，诊断和预测糖尿病视网膜病变进展的灵敏度和特异性，高于血葡萄糖或者泪液某一单糖。因此，本发明提供了一种无创方式进行监测早期糖尿病视网膜病变进展的生物标记物，对降低或者减少糖尿病视网膜病变带来的损害具有重要意义。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
17.图1为4种单糖和乳酸检测的标准曲线；图2为糖尿病视网膜病变患者与正常对照人群泪液葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖和乳酸的水平；（a）葡萄糖；（b）果糖；（c）半乳糖；（d）甘露糖；（e）乳酸；图3为空腹血葡萄糖与空腹泪液中葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖和乳酸之间的线性关系；（a）葡萄糖；（b）果糖；（c）半乳糖；（d）甘露糖；（e）乳酸；图4为空腹血糖以及泪液中不同生物标记物组合评估糖尿病视网膜病变进展的roc曲线；（a）-（c）为dr人群与正常对照组人群对比；（d）-（f）为pdr和npdr人群对比，更具体的为，（a）和（d）为空腹血糖水平的roc曲线；（b）和（e）为空腹泪液葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖和乳酸单一代谢物浓度的roc曲线；（c）和（f）为空腹泪液葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖
μl，涡旋1 min混匀（总体积400 μl），40 ℃反应1小时，期间5分钟震荡一次；（3）反应完成后12000 rpm，4 ℃离心15 min取上清上机作lc-ms/ms 分析。
27.4、仪器参数4.1仪器：液相色谱 waters acquity uplc，质谱 ab sciex 5500 qqq-ms。
28.色谱柱：acquity uplc hss t3（1.8
ꢀµ
m，2.1 mm*100 mm）。
29.4.2 uplc-qqq-ms方法：色谱分离条件：柱温：40 ℃，流速：0.30 ml/min。
30.流动相组成：a-水（0.01%甲酸），b-乙腈（0.01%甲酸）。
31.运行时间：5 min，进样量：6
ꢀµ
l，样本梯度洗脱程序见下表。
32.表1 样本梯度洗脱程序4.3质谱条件离子源（ion source）：esi离子源；气帘气（curtain gas）：20 arb；碰撞气（collision gas）：9 arb；离子喷雾电压（ionspray voltage）：-4200v；离子源温度（temperature）：450 ℃；离子源气体（ionsource gas1）：35 arb；离子源气体（ionsource gas2）：35 arb。
33.4.4 mrm采集参数按照上述及表1中的色谱及质谱条件，将配制好的标准品溶液加入进样瓶中，进样；物质峰确定的保留时间见表2。
34.表2 质谱mrm采集参数
5、数据分析利用multiquant软件进行积分，利用标准曲线进行含量计算。
35.5.1 标准曲线5.1.1 标准品溶液的配制（1）精密称取标品20 mg，溶于1 ml 50%乙腈溶液中；（2）分别移取标品和配制的3-nph（200 mm）和edc（120 mm；含6%吡啶）溶液（2:1:1，v/v/v）涡旋1 min混匀（总体积1 ml）；（3）40 ℃反应1小时，期间5分钟震荡一次；（4）先单标进行衍生化，待衍生化完成后用50%乙腈配制成混标；（5）用50%乙腈（稀释）成浓度为相适应的标准系列溶液。标准溶液现用现配。
36.5.1.2 标准曲线绘制以短链脂肪酸的浓度为横坐标、以短链脂肪酸的峰面积为纵坐标进行线性回归， r2均大于0.99，详见图1，说明标准曲线的线性关系较好，可用于样本中5种物质浓度（葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、乳酸）的计算。
37.6、统计分析连续变量以均数
±
标准差(sd)表示，比较采用独立样本t检验或单因素方差分析(anova)，事后错误发现率(fdr)多次检验校正。分类数据采用χ2检验进行评估。pearson相关分析血糖水平与泪液单糖、乳酸水平的相关性。进行受试者工作特征(roc)分析，评估单糖和乳酸预测dr和pdr的敏感性和特异性。所有统计分析均使用商用软件(ibm spss statistics 22；spss inc.，芝加哥，伊利诺伊州)。p 《 0.05为差异有统计学意义。
38.7、结果（1）五种物质（葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖及乳酸）在对照组、npdr组、pdr组中的含量。
39.如图2所示，随着疾病的进展，泪液中五种物质的浓度逐渐增加，且乳酸在pdr组的含量增加最具有统计学意义。
40.（2）在dr患者中，发现血葡萄糖水平与泪液葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖水平呈现
线性相关。
41.如图3所示，血葡萄糖水平与泪液甘露糖水平呈现高度线性相关，与泪液葡萄糖、果糖、半乳糖水平呈现中度相关，与乳酸水平基本无相关性。提示乳酸是一独立的危险因素，独立于血糖水平调节。
42.（3）对于dr和pdr的预测结果，如图4所示，roc曲线结果表明：
①
对于区分糖尿病视网膜病变和非糖尿病视网膜病变，血糖的auc为0.871，泪液中葡萄糖，果糖、半乳糖、甘露糖、乳酸的auc分别为0.709，0.737，0.738，0.727，0.658；泪液中五种成分组合的auc为0.754。
43.②
对于区分pdr和npdr，血糖的auc为0.566，泪液中葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、乳酸的auc分别为0.590，0.649，0.662，0.650，0.896；泪液中五种成分组合的auc为0.947。
44.上述结果提示泪液乳酸可能是一潜在的新的生物标记物用来评估pdr；泪液葡萄糖，果糖、半乳糖、甘露糖、乳酸可能是潜在的新的生物标记物组合用来评估pdr，预测dr进展。
45.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。