同时测定盐酸布比卡因多种潜在基因毒性杂质的检测方法与流程

同时测定盐酸布比卡因多种潜在基因毒性杂质的检测方法
1.技术领域
2.本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种可同时测定盐酸布比卡因中多种潜在基因毒性杂质的检测方法。


背景技术：

3.盐酸布比卡因的化学名为1-丁基-2-[n-(2,6-二甲基苯胺甲酰基)]哌啶盐酸盐，其主要以2-哌啶甲酸为原料与溴丁酸反应生成中间体1-丁基-n-哌啶甲酸丁酯，进一步与2，6-二甲基苯胺作用得到布比卡因，酸化成盐即生成盐酸布比卡因。
[0004]
2，6-二甲苯胺作为重要的有机化工中间体，被广泛应用于医药、颜料以及农药等生产领域，以其为原料的医药品种主要有奈非西坦、盐酸吡西卡尼、盐酸罗哌卡因、盐酸布比卡因等。而2,6-二甲基苯胺的合成工艺中可能产生2,3-二甲基苯胺，2,4-二甲基苯胺，2,5-二甲基苯胺，邻乙基苯胺，2,3-二甲基硝基苯，2,4-二甲基硝基苯，2,5-二甲基硝基苯，邻乙基硝基苯等杂质，这9个化合物具有苯胺或硝基苯类结构，根据欧洲药品管理局于2006年6月28日颁布的《基因毒性杂质限度指南》所述，该类杂质均被认为含有警示结构，或者称为基因毒性杂质，可能对人体产生严重的毒副作用，引起基因突变甚至癌变，因此需要细致而深入的研究和控制，以确保其不会影响产品的质量。
[0005]
申请人在长期的研发过程中发现，基因毒性杂质的质量控制和检测一直是药物质量研究的难点，因为其限度极低，常需要借助于质谱等灵敏度更高的仪器，成本高，不适合部分中小企业。本发明中这几个化合物结构类似，沸点和极性都很接近，分离难度极大，很难在准确定量的同时将所有杂质峰都有效分离。经过前期的文献检索，目前苯胺类的检测方法以高效液相色谱法和分光光度法居多，气相色谱法则较少，且暂未发现同时检测这9种杂质的文献或专利报道，因此亟需开发出一种同时检测这几种潜在基因毒性杂质含量的方法。


技术实现要素：

[0006]
本发明主要解决的技术问题是提供一种能同时分离和检测盐酸布比卡因中多种潜在基因毒性杂质的方法。
[0007]
为解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：本发明所述同时测定盐酸布比卡因中多种潜在基因毒性杂质的检测方法，该检测方法以稀释液配制待测溶液，采用气相（gc-fid)直接进样法检测样品中的潜在基因毒性杂质，所述样品包括盐酸布比卡因原料药及制剂，所述潜在基因毒性杂质包括：2,6-二甲基苯胺，2,3-二甲基苯胺，2,4-二甲基苯胺，2,5-二甲基苯胺，邻乙基苯胺，2,3-二甲基硝基苯，2,4-二甲基硝基苯，2,5-二甲基硝基苯，邻乙基硝基苯中的一种或多种。
[0008]
优选地，所述检测方法包括如下步骤：
s1、配制溶液配制对照溶液，称取各杂质对照品，加稀释液溶解，制成浓度为2.0~5.0μg/ml的对照溶液；配制供试品溶液，称取供试品，加稀释液溶解，制成浓度为50~200mg/ml的供试品溶液；s2、取稀释液，对照溶液，供试品溶液注入气相色谱仪进行气相色谱检测。
[0009]
优选地，所述稀释液为甲醇。
[0010]
优选地，所述待测溶液包括对照溶液和供试品溶液，所述对照溶液中各杂质浓度为2.5μg/ml，所述供试品溶液的浓度为100mg/ml。
[0011]
优选地，所述气相色谱条件还包括：气相色谱柱为毛细管柱，柱长为60m，内径为0.32mm，膜厚为0.25μm。
[0012]
优选地，所述气相色谱条件还包括：所述气相色谱柱的固定相为聚乙二醇。
[0013]
优选地，所述气相色谱条件还包括：所述气相色谱柱的型号为db-wax。
[0014]
优选地，所述气相色谱条件还包括：起始柱温100~140℃，程序升温至160~240℃，升温速率为2~8℃/min。
[0015]
优选地，所述气相色谱条件还包括：载气为氮气。
[0016]
优选地，所述气相色谱条件还包括：所述载气流速为1.0~1.5ml/min。
[0017]
优选地，所述气相色谱条件还包括：进样口温度为200~250℃。
[0018]
优选地，所述气相色谱条件还包括：进样量为1.0μl，分流比为5:1。
[0019]
优选地，所述气相色谱条件还包括：检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为220~270℃。
[0020]
各基因毒性杂质的基本信息见表1。
[0021]
表1：各基因毒性杂质的基本信息。编号名称结构式cas号沸点偶极矩12,6-二甲基苯胺87-62-7216℃1.1d22,3-二甲基苯胺87-59-2222℃1.6d32,4-二甲基苯胺95-68-1218℃1.7d42,5-二甲基苯胺95-78-3218℃1.5d
5邻乙基苯胺578-54-1210℃/62,3-二甲基硝基苯83-41-0245℃4.1d72,4-二甲基硝基苯99-51-4244℃4.8d82,5-二甲基硝基苯89-58-7240℃4.0d9邻乙基硝基苯612-22-6228℃/
[0022]
本发明的优势在于：采用普通的气相色谱方法就能够同时准确分离和定量2,6-二甲基苯胺，2,3-二甲基苯胺，2,4-二甲基苯胺，2,5-二甲基苯胺，邻乙基苯胺，2,3-二甲基硝基苯，2,4-二甲基硝基苯，2,5-二甲基硝基苯，邻乙基硝基苯这9个杂质，方法灵敏度高，准确可靠，适用于盐酸布比卡因中潜在基因毒性杂质的检测。
附图说明
[0023]
图1是本发明实验例1的空白溶液检测色谱图；图2是本发明实验例1的对照溶液检测色谱图；图3是本发明实验例1的供试品溶液检测色谱图。
具体实施方式
[0024]
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下将通过具体实施例对本发明进一步说明、解释，但这仅是示例性方案，不应用来限制本发明的范围。其中，实验例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟知的意义相同。
[0025]
本发明具体实施例中使用的对照品信息见表2。
[0026]
表2：对照品信息。对照品名称来源批号含量2,6-二甲基苯胺沃凯2019081599.80%2,3-二甲基苯胺百灵威l430r6399.41%2,3-二甲基硝基苯tcigf01-pcii99.90%
2,4-二甲基苯胺百灵威l660r13299.99%2,4-二甲基硝基苯tcifay01-icst99.00%2,5-二甲基苯胺百灵威lr50t10099.81%2,5-二甲基硝基苯tcifgk01-sdqi99.60%邻乙基苯胺tci4jbzj-an99.20%邻乙基硝基苯tcihaq01-oild99.00%
[0027]
本发明具体实施例中使用的供试品盐酸布比卡因均为自制，批号为2111001、2111002、2111003。
[0028]
本发明具体实施例中使用的仪器及色谱柱信息见表3。
[0029]
表3：仪器及色谱柱信息。名称型号厂家电子天平xs205梅特勒电子天平ml204梅特勒气相色谱仪agilent7890a安捷伦工作站openlabcds2.4安捷伦色谱柱db-wax安捷伦
[0030]
实施例11.1色谱条件色谱柱：db-wax (60m
×
0.32mm，0.25μm)柱流速：1.3ml/min；进样口温度：220℃；检测器（fid）温度：250℃；柱温：120℃以4℃/min上升至170℃，维持2min，再以3℃/min上升至180℃，维持8min；进样量：1.0μl；分流比：5:1。
[0031]
1.2溶液的配制精密称取2,6-二甲基苯胺，2,3-二甲基苯胺，2,4-二甲基苯胺，2,5-二甲基苯胺，邻乙基苯胺，2,3-二甲基硝基苯，2,4-二甲基硝基苯，2,5-二甲基硝基苯，邻乙基硝基苯，用甲醇溶解并稀释，混合制成各杂质浓度均为0.25mg/ml的对照储备溶液。
[0032]
精密移取对照储备溶液，用甲醇稀释，混合制成各杂质浓度均为2.5μg/ml的对照溶液。
[0033]
分别精密称取2,6-二甲基苯胺，2,3-二甲基苯胺，2,4-二甲基苯胺，2,5-二甲基苯胺，邻乙基苯胺，2,3-二甲基硝基苯，2,4-二甲基硝基苯，2,5-二甲基硝基苯，邻乙基硝基苯，用甲醇溶解并稀释，制成浓度均为2.5μg/ml的定位溶液。
[0034]
精密称取供试品，用甲醇溶解并稀释，制成浓度为100mg/ml的供试品溶液。
[0035]
1.3测定方法取稀释液，对照溶液，供试品溶液各1μl分别注入气相色谱仪，记录色谱图。以外标法计算各杂质含量。
[0036]
1.4测定结果按照上述方法检测3批盐酸布比卡因供试品中2,6-二甲基苯胺，2,3-二甲基苯胺，2,4-二甲基苯胺，2,5-二甲基苯胺，邻乙基苯胺，2,3-二甲基硝基苯，2,4-二甲基硝基苯，2,5-二甲基硝基苯，邻乙基硝基苯的含量，结果见表4。
[0037]
表4：三批供试品检测结果。
[0038]
从以上结果可以看出，3批供试品中各杂质均未检出，符合限度要求（≤25ppm）。
[0039]
1.5将上述盐酸布比卡因中多种潜在基因毒性杂质的检测方法进行方法学验证：专属性与系统适用性考察取稀释液、对照溶液、供试品溶液、各组分定位溶液按照1.1中的色谱条件分别进行检测，其中对照溶液连续进6针，其余各进1针，检测结果见表5。
[0040]
表5：专属性与系统适用性检测结果。
[0041]
从以上结果可以看出，此方法中稀释液和供试品对各杂质的检测均无干扰，各杂质间的分离度均大于1.5，6针峰面积rsd均＜5%，表明该方法专属性良好，仪器系统精密度较佳。
[0042]
定量限和检测限考察将对照溶液稀释至一定浓度，以杂质峰信噪比约为10:1时的浓度为定量限浓度，连续进6针定量限溶液；以杂质峰信噪比约为3:1时的浓度为检测限浓度，连续进2针检测限溶液，检测结果见表6。
[0043]
表6：定量限和检测限检测结果。
[0044]
从以上结果可以看出，此方法中各杂质的检测限和定量限较低，说明方法的检测灵敏度高，可以充分满足测定要求。
[0045]
线性与范围考察将对照储备溶液稀释制成不同浓度的线性溶液。分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。线性与范围结果见表7。
[0046]
表7：线性与范围检测结果。名称线性方程相关系数范围邻乙基硝基苯y=3.4442x+0.22680.99990.50~5.03μg/ml2,6-二甲基苯胺y=3.6845x+0.08270.99990.53~5.26μg/ml邻乙基苯胺y=4.1468x+0.06950.99960.52~5.17μg/ml2,4-二甲基苯胺y=4.0757x+0.12680.99970.51~5.11μg/ml2,5-二甲基硝基苯y=3.5903x+0.21050.99950.51~5.05μg/ml2,5-二甲基苯胺y=3.5479x+0.16140.99940.51~5.13μg/ml2,4-二甲基硝基苯y=3.2739x+0.2250.99990.51~5.07μg/ml2,3-二甲基硝基苯y=3.6866x+0.47090.99970.50~5.01μg/ml2,3-二甲基苯胺y=4.3648x+0.290.99950.51~5.13μg/ml
[0047]
从以上结果可以看出，此方法中各杂质均具有良好的线性关系。
[0048]
精密性考察按照1.2中的供试品溶液配制方法，平行配制6份，分别进行检测。重复性结果见表8。
[0049]
表8：重复性检测结果。
[0050]
。
[0051]
由另一实验人员，在不同时间按照1.2中的对照溶液、供试品溶液配制方法，平行配制6份供试品溶液，在另一台仪器上进行检测。中间精密度结果见表9。
[0052]
表9：中间精密度检测结果。
[0053]
。
[0054]
从以上结果可以看出，12份供试品溶液中均未检出各杂质，方法精密度良好。
[0055]
准确度考察精密称取供试品，定量加入对照储备溶液，加稀释液制成回收率溶液。高中低浓度各平行配制3份。准确度结果见表10。
[0056]
表10：准确度检测结果。
[0057]
。
[0058]
从以上结果可以看出，本方法测得各杂质的回收率均在90.0%~110.0%范围内，回收率rsd＜5%，表明该方法的检测准确度良好。
[0059]
耐用性考察分别微调1.1色谱条件中的初始柱温（
±
2℃）、柱流速（
±
0.1ml/min）、进样口温度（
±
5℃）、检测器温度（
±
5℃）、进样量（
±
0.2μl）、色谱柱编号，其他条件不变，检测对照溶液和供试品溶液，耐用性结果见表11。
[0060]
表11-1：耐用性系统适用性检测结果。
[0061]
。
[0062]
表11-2：耐用性供试品检测结果。
[0063]
。
[0064]
从以上结果可以看出，微调各色谱条件后系统适用性仍符合要求，对各杂质的检测无影响，方法耐用性强。
[0065]
溶液稳定性将对照溶液和供试品溶液在常温下放置56h，在不同时间点进行检测。溶液稳定性结果见表12。
[0066]
表12-1：对照溶液稳定性检测结果。
[0067]
。
[0068]
表12-2：供试品溶液稳定性检测结果。
[0069]
。
[0070]
从以上结果可以看出，对照溶液和供试品溶液在常温下放置56h不影响其测定结果，稳定性良好。
[0071]
以上所述仅为本发明的较优实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。