一种荧光检测探针的制备方法及其产品和应用

本发明涉及一种荧光检测探针的制备方法及其产品和应用，属于荧光免疫检测。

背景技术：

1、钙钛矿量子点由于其制备工艺简单，发射波长和能隙可调，荧光强度高，电荷转移速度快，受到广泛的重视。并且近年来，该材料在光电器件、光电检测、器件等方面都具有广阔的应用前景。但是其稳定性较差，尤其是对存在水的环境十分敏感，这在一定条件下限制了其实际应用的发展。

2、近几年来，多巴胺开始被用作为一种仿生粘附材料，在碱性环境中，多巴胺可以通过氧化自聚合，生成聚多巴胺(pda)。研究表明，在ph为8.5时，氧化自聚反应的效果是良好的，所形成的聚多巴胺膜可以覆盖于不同的材料表面。由于聚多巴胺包含有n基团和酚羟基，所以经过pda所包被的材料，其表面上将会具有很多活性基团，能够在不加入活化剂的条件下进一步与化合物或生物分子的官能团进行反应。现在，在检测血清中的igg时通常会采用酶联免疫吸附法(elisa)。尽管利用酶解反应产物的吸光度可以对目标物进行定性和定量检测，但在elisa中，须使用酶蛋白作为标记物，而去除样品中其它物质的干扰作用，则需要繁琐的预处理过程。因此，需要建立一种高灵敏、准确、稳定的人igg检测方法。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一目的是提供一种荧光检测探针的制备方法，本发明的第二目的是提供一种该方法得到的荧光检测探针，本发明的第三目的是提供一种利用该荧光检测探针在检测人igg中的应用。

2、技术方案：本发明提供一种荧光检测探针的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)制备水相稳定cspbbr3钙钛矿；

4、(2)将水相稳定cspbbr3钙钛矿进行功能化处理；

5、(3)利用功能化后的水相稳定cspbbr3钙钛矿与兔抗人igg(ab2igg)进行偶联，得到荧光检测探针。

6、其中，步骤(1)中，制备水相稳定cspbbr3钙钛矿包括以下步骤：将六水合硝酸锌、2-甲基咪唑、溴化铅和溴化铯混合，依次加入到甲醇和n,n-二甲基甲酰胺溶液的混合溶液中，搅拌，得到混合溶液，离心，洗涤，真空干燥，得到水相稳定cspbbr3钙钛矿cspbbr3@zif-8。

7、其中，六水合硝酸锌、2-甲基咪唑、溴化铅和溴化铯的摩尔比为(1.0～1.2):(8.0～8.1):1:1。

8、其中，甲醇和n,n-二甲基甲酰胺的体积比为9:(1.0～1.3)。

9、其中，六水合硝酸锌的物质的量与甲醇体积比为1:(9～9.2)mmol/ml。

10、其中，搅拌反应的时间为5.5～8h。

11、其中，离心转速为8000～10000r，离心时间为6～10min。

12、其中，洗涤是用去离子水进行洗涤。

13、其中，真空干燥是在60～65℃℃下干燥3～4h。

14、其中，步骤(2)中，将水相稳定cspbbr3钙钛矿进行功能化处理包括以下步骤：将水相稳定cspbbr3钙钛矿在pbs溶液中与盐酸多巴胺室温条件下搅拌混合，离心洗涤，真空干燥，得到功能化的水相稳定cspbbr3钙钛矿。

15、其中，水相稳定cspbbr3钙钛矿与盐酸多巴胺的质量比为(10.0～10.4):1。

16、其中，pbs溶液的浓度为0.10～0.12mol/l。

17、其中，水相稳定cspbbr3钙钛矿与pbs溶液的固液比为10:(1.0～1.2)mg/ml。

18、其中，搅拌混合的时间为50～60min。

19、其中，真空干燥是在60-65℃下干燥3-3.5h。

20、其中，步骤(3)中，荧光检测探针的制备包括以下步骤：

21、(1)将功能化的水相稳定cspbbr3钙钛矿加入到戊二醛的pbs溶液，搅拌反应，离心分离，用pbs溶液洗涤，真空干燥，得到粉末；

22、(2)将粉末加入兔抗人igg(ab2igg)的pbs溶液中孵育，离心分离，用pbs溶液洗涤，用bsa溶液封闭，用pbs溶液洗涤并配成溶液即得荧光检测探针溶液。

23、其中，步骤(1)中，戊二醛的pbs溶液体积浓度为5％。

24、其中，步骤(1)中，功能化的水相稳定cspbbr3钙钛矿与戊二醛的pbs溶液的液固比为100:(5～8)mg/ml。

25、其中，步骤(1)中，搅拌反应的时间为1.5～2h。

26、其中，步骤(2)中，兔抗人igg的pbs溶液浓度为10～11μg/ml。

27、其中，步骤(2)中，粉末与兔抗人igg的质量比为(500～510)：1。

28、其中，步骤(2)中，孵育是在25℃下孵育1.5～2h。

29、其中，步骤(2)中，用bsa溶液封闭的时间为30min以上。

30、本发明所述的制备方法得到的荧光检测探针。

31、本发明所述荧光检测探针在检测人igg中的应用。

32、本发明所述的应用，包括以下步骤：

33、(1)对数关系曲线的建立：酶孔板用盐酸多巴胺的pbs溶液和戊二醛的pbs溶液进行功能化处理，用pbs溶液清洗，加入山羊抗兔(ab1igg)的pbs溶液，孵育，用pbs溶液清洗，用bsa的pbs溶液封闭，用pbs溶液清洗，加入不同浓度的抗原人igg的pbs溶液，孵育，用pbs溶液清洗，再加入本发明所述的荧光检测探针溶液，室温孵育，用酶标仪检测荧光强度，根据荧光强度与抗原人igg的pbs溶液的浓度建立对数关系曲线；

34、(2)样品检测：按照步骤(1)的过程，用经pbs溶液稀释后的实际血清样本替代不同浓度的抗原人igg的pbs溶液，根据对数关系曲线定量实际血清样品本中igg的浓度。

35、其中，步骤(1)中，盐酸多巴胺的pbs溶液的浓度为(10.0～10.5)mg/ml。

36、其中，步骤(1)中，酶孔板中每孔中盐酸多巴胺的pbs溶液的用量为200～300μl。

37、其中，步骤(1)中，用盐酸多巴胺的pbs溶液进行功能化处理的时间为3.5～4h。

38、其中，步骤(1)中，戊二醛的pbs溶液的体积浓度为5％。

39、其中，步骤(1)中，酶孔板的每孔中戊二醛的pbs溶液的用量为200～300μl。

40、其中，步骤(1)中，用戊二醛的pbs溶液进行功能化处理的时间为1～2h。

41、其中，步骤(1)中，山羊抗兔(ab1igg)的pbs溶液的浓度为10～11μg/ml。

42、其中，步骤(1)中，酶孔板中每孔中山羊抗兔(ab1igg)的pbs溶液的用量为100～110μl。

43、其中，步骤(1)中，加入山羊抗兔(ab1igg)的pbs溶液孵育的时间为80～90min。

44、其中，步骤(1)中，bsa的pbs溶液的浓度为(1.0～1.2)％。

45、其中，步骤(1)中，用bsa的pbs溶液封闭的时间为30min以上。

46、其中，不同浓度的抗原人igg的pbs溶液的浓度分别为100μl

47、1.0×10-4μg/ml、1.0×10-3μg/ml、5.0×10-3μg/ml、1.0×10-2μg/ml、

48、5.0×10-2μg/ml、1.0×10-1μg/ml、5.0×10-1μg/ml、1.0μg/ml和5.0μg/ml。

49、其中，步骤(1)中，加入不同浓度的抗原人igg的pbs溶液孵育的时间为90～120min。

50、其中，步骤(1)中，荧光检测探针溶液的浓度为(5～5.2)mg/ml，荧光检测探针溶液的用量为每孔100～110μl。

51、其中，步骤(1)中，室温孵育的时间为90～120min。

52、其中，前述所有的pbs溶液的浓度均为0.10～0.12mol/l，ph为7.4，用磷酸氢钠和磷酸氢二钠自行配置；

53、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

54、(1)本发明制备钙钛矿材料过程的方法简单，操作简便，并且能够进行大批量的制备；

55、(2)本发明中所使用的钙钛矿材料荧光信号强，并且金属有机框架zif-8和2-甲基咪唑的协同作用使其在水相中有好的稳定性，提高了检测的灵敏度和准确性；

56、(3)本发明中用盐酸多巴胺包被钙钛矿制备成荧光检测探针，偶联抗体的成功率高。

57、(4)本发明中制备的荧光检测探针应用到检测人igg的含量，线性范围宽，灵敏度高，检测限较低，特异性识别，大通量检测等优点。