咽立爽口含滴丸中有效成分的含量测定方法及GC-MS指纹图谱的建立方法

本发明涉及药品检测，具体涉及咽立爽口含滴丸中有效成分的含量测定方法及gc-ms指纹图谱的建立方法。

背景技术：

1、咽立爽口含滴丸是贵州黄果树立爽药业有限公司生产的由艾片、艾纳香油、薄荷素油、薄荷脑、甘草酸单铵盐和辅料聚乙二醇6000组成的苗药复方制剂，有特异香气，味甜、微苦，具有疏风散热、消肿止痛、清利咽喉的功效，用于急性咽炎、慢性咽炎急性发作、咽痛、咽黏膜红肿、咽干、口臭等症。艾片为菊科艾纳香属植物艾纳香blumea balsami era(l.)dc.的新鲜叶经提取加工制成的结晶，主要成分为龙脑，含有少量的樟脑、异龙脑，具有开窍醒神，清热止痛的功效。在精制艾片的过程中粗提物经压榨分离而得到的油即为艾纳香油，主要成分为β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑、α-石竹烯和龙脑，具有清热解毒、消炎止痛、抗菌止痒、局部麻醉等功效，用于治疗咽喉肿痛、口疮、皮肤晒烧烫伤、湿疹、结肠炎及蚊虫叮咬等。薄荷素油为唇形科植物薄荷mentha haplocalyx briq.的新鲜茎和叶经水蒸气蒸馏，再冷冻，部分脱脑加工得到的挥发油，主要成分为薄荷脑、薄荷酮、薄荷脑乙酸酯、柠檬烯，可用于皮肤或黏膜产生清凉感以减轻不适及疼痛、抗炎抗菌抗氧化、利胆及预防胆固醇结石等。

2、中药质量研究一直是中药现代化研究的重点和热点，中药在贮存过程中可能会有部分化学成分发生变化，对这些易发生质和量变化的成分的控制成为中药质量控制的主要聚焦点。而由艾片、艾纳香油、薄荷素油、薄荷脑、甘草酸单铵盐制备而成的咽立爽口含滴丸，其化学成分复杂且挥发性强，只有多指标成分的共同检测才能达到对所需有效成分的质量控制，但现行局颁发的标准仅有气相色谱法测定其艾片、薄荷脑的含量检测指标及方法(要求本品每克含薄荷脑不得少于30.0mg、含龙脑不得少于75.0mg)及tlc定性鉴别甘草酸单铵盐(采用hplc以羟基苯甲酸丁酯为内标物测定甘草酸单铵盐含量)，不能全面控制该复方制剂的质量。中药指纹图谱是一种多指标质量控制模式，通过对共有峰的分析较全面地反映所含化学成分的种类和数量，从而反映药品的质量，在中药制剂的质量评价中应用广泛。但是现有的中药指纹图谱仅仅是关注多种组分，却没有对主要组分以及组分的配合进行测定，同时仅仅是采用指纹图谱定性评价，而忽略了定量评价。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，设计一种利用gc-ms法测定咽立爽口含滴丸中四种主要药效成分樟脑、薄荷酮、龙脑、薄荷脑的含量的方法。

2、本发明的目的之一是提供一种咽立爽口含滴丸中有效成分的含量测定方法，包括以下步骤：

3、1)取内标物萘制备内标溶液；

4、2)取咽立爽口含滴丸样本制备供试品溶液；

5、3)取2个以上待测有效成分的样品制备对照品储备液，将全部的对照品储备液混合；

6、4)gc-ms条件；

7、5)sim模式定量方法的建立：分别精密吸取步骤3)项下混合对照品溶液置于棕色容量瓶中，分别加入步骤1)项下内标溶液，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列标准溶液；在scan模式下扫描，将所得数据进行sim模式定量方法的建立，得到有效成分的定性定量离子对，最终同时得到多个有效成分的含量。

8、进一步的，有效成分包括但不限于樟脑、薄荷酮、龙脑和薄荷脑。

9、进一步的，步骤4)的气相色谱条件：色谱柱为30m×0.25mm，0.25μm的弹性石英毛细管柱，载气为高纯度氦，柱流量0.78ml/min，程序升温条件：初始柱温75℃保持2min，以2.0℃/min升温至110℃，仅19.50min完成分析；进样口温度250℃，进样量1.0μl，分流进样，分流比为50:1；

10、质谱条件：离子源为电子轰击离子源，轰击能量为70ev，离子源温度200℃，接口温度250℃，溶剂延迟时间为5min，扫描方式q3 scan，质量扫描范围：45-200amu，检测器电压0kv。

11、进一步的，咽立爽口含滴丸中四种有效成分的含量测定方法的步骤具体为：

12、1)内标溶液的制备：取内标物萘，精密称定，置100ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成800ug/ml的内标溶液；

13、2)供试品溶液的制备：取咽立爽口含滴丸样本，精密称定，加入甲醇，加入步骤1)的内标溶液，称重，精密称重，超声处理10min，放冷，甲醇补足失重，加入无水硫酸钠脱水，0.22μm微孔滤膜过滤，即得；

14、3)对照品储备液的制备：取樟脑对照品、薄荷酮对照品、龙脑对照品和薄荷脑，精密称定，置于棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成5mg/ml的樟脑对照品储备液、5mg/ml的薄荷酮对照品储备液，20mg/ml的龙脑对照品储备液，8mg/ml的薄荷脑对照品储备液；

15、4)混合对照品溶液的制备：分别精密吸取步骤3)下制备的樟脑对照品储备液、薄荷酮对照品储备液、龙脑对照品储备液、薄荷脑对照品储备液置于棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得樟脑浓度为0.5mg/ml、薄荷酮浓度为0.5mg/ml、龙脑浓度为6.0mg/ml、薄荷脑浓度为2.4mg/ml的混合对照品溶液；

16、5)色谱峰的鉴定与指认：取步骤2)制备的供试品溶液，向步骤4)的混合对照品溶液中加入步骤1)制备的内标溶液适当稀释后，进样测定，结合nist标准质谱数据库检索及对照品比对，对色谱峰进行鉴定与指认；

17、6)sim模式定量方法的建立：分别精密吸取步骤4)的混合对照品溶液多组置于棕色容量瓶中，分别加入步骤1)的内标溶液，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列标准溶液；在scan模式下扫描，将所得数据进行sim模式定量方法的建立和计算，选择的定性定量离子对为：樟脑，m/z 95→81/108；薄荷酮，m/z 112→69/139；龙脑，m/z 95→110/67；薄荷脑，m/z81→71/95，最终同时得到4个有效成分的含量。

18、本发明的目的之二是提供上述方法在咽立爽口含滴丸及其他含有樟脑、薄荷酮、龙脑及薄荷脑四种成分药物中的应用。

19、本发明的工作原理及有益效果：本发明基于gc-ms法(气相色谱-质谱联用)建立了咽立爽口含滴丸中四种主要药效成分樟脑、薄荷酮、龙脑、薄荷脑的含量测定方法，能特异性检测咽立爽口含滴丸中四种主要药效成分樟脑、薄荷酮、龙脑、薄荷脑的含量，色谱峰分离良好、无干扰、线性好、精确度高、重复性、回收率、稳定性高。可以更为全面地保证咽立爽口含滴丸制剂质量稳定、产品批间一致和临床用药安全有效。

20、本发明的目的之三是提供咽立爽口含滴丸gc-ms指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

21、(1)供试品溶液的制备：取咽立爽口含滴丸，精密称定，加入甲醇，精密称重，超声处理10min，放冷，甲醇补足失重，加入无水硫酸钠脱水，0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶；(2)gc-ms分析：精密吸取供试品溶液1.0μl，注入gc-ms色谱仪，色谱条件如下：色谱柱：30m×0.25mm，0.25μm弹性石英毛细管柱sh-rxi-5sil ms；载气为氦气；柱流量1.0ml/min；程序升温条件：初始柱温70℃，以1.5℃/min升温至90℃，以3℃/min升温至120℃，以20℃/min升温至250℃保持2min至完成分析；进样口温度250℃；进样量1.0μl；分流进样，分流比为30:1；质谱条件：离子源为电子轰击离子源，轰击能量为70ev；扫描方式q3 scan，质量扫描范围：30-700amu；(3)测定10批以上的样品及对照指纹图谱的gc-ms图进行拟合，得到gc-ms叠加指纹图谱。

22、样品优选为10批以上，20批以下，优选12批、13批、14批、15批、18批。

23、本发明的目的之四是提供上述方法建立的咽立爽口含滴丸gc-ms指纹图谱。

24、本发明采用gc-ms建立了咽立爽口含滴丸指纹图谱，共标记了18个共有峰，指认了4个特征峰反映其物质基础并测定含量，将模糊鉴别与精准定量分析相结合，提供了系统快速评价该制剂质量的方法。该方法操作简单、重复性好、专属性强，比目前采用气相色谱分析具有节省时间、灵敏度高的优点，为阐明药效物质基础和基于挥发性成分的质量控制提供科学依据。

25、本发明分别考察了甲醇、无水乙醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、二氯甲烷作为供试品的提取溶剂，按照供试品溶液制备方法提取，相同色谱条件进样分析，结果发现几种溶剂提取液总离子流色谱图色谱峰峰数相同，色谱峰分离度无明显差异，甲醇提取液无色透明且稳定，提取效率高于其他溶剂，且总离子流色谱图峰形较好，因此选择甲醇作为最终提取溶剂。选择萘作为内标物时，内标物峰与试样中所有成分的峰完全分离，且与目标成分峰保留时间接近。

26、本发明还分别考察了0.78ml/min、1.0ml/min、1.5ml/min三个色谱柱流速，结果发现随着流速增加，出锋时间提前，色谱峰分离度无明显变化，0.78ml/min流速时响应信号最好，因此选择0.78ml/min作为色谱柱流速。接着考察了10:1、30:1、50:1三个分流比，结果发现分流比为10:1时检测器饱和，30:1比50:1响应信号较好，因此选择分流比为50:1。由于样品是中成药，基质复杂，因此选择程序升温方式进行考察，同时尽可能使样品在较短时间内出峰。首先分别考察了70℃、75℃、80℃作为程序升温的初始温度，结果发现随着初始温度增加，龙脑与薄荷脑之间的分离度降低，而薄荷脑与内标萘之间的分离度增加。接下来考察了1.0℃/min、1.5℃/min、2.0℃/min作为程序升温的升温速率，结果发现，与初始温度考察结果相同，随着升温速率的增加，龙脑与薄荷脑之间的分离度降低，而薄荷脑与内标萘之间的分离度增加。综合考虑，选择75℃作为程序升温的初始温度，1.5℃/min作为程序升温的升温速率时，龙脑与薄荷脑之间、薄荷脑与内标萘之间的分离度均满足分析要求。