一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的UPLC-MS/MS方法与流程

一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-ms/ms方法
技术领域
1.本发明涉及水产品污染检测技术领域，具体涉及一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-ms/ms方法。


背景技术：

2.持久性有机污染物(pops)具有广布性、持久性和多毒性等特点，并可以通过食物链蓄积放大，对人体和生态环境产生严重危害。多溴联苯醚(pbdes)属于目前重点关注的毒害性卤代阻燃剂，在环境介质和生物体内被广泛检出。其中含有4-7个溴原子的4种pbdes和hbcd已经被列入pops名单。pbdes可经由食物链蓄积放大，在许多水产品如鱼类、贝类等体内均有不同浓度的pbdes检出。
3.2,2’,4,4
’‑
四溴联苯醚(bde-47)是环境中丰度较高的pbdes同系物之一，在自然环境尤其是海洋环境中分布较广，具有生物蓄积特性和较强的神经毒性、遗传毒性、免疫毒性等，属于新型pops。毒理学研究表明，bde-47的两类衍生物甲氧基化bde-47(meo-bde47)和羟基化bde-47(ho-bde47)的毒性作用高于母体化合物bde-47本身，食用受bde-47及其代谢物污染的水产品或可引发严重的健康问题。
4.目前，测定水产品中bde-47羟基化和甲氧基衍生物的检测方法未见相关标准。羟基化和甲氧基bde-47的测定方法有气相色谱-质谱法(gc-ms)和液相色谱串联质谱(hplc-ms)法，并且多以单一代谢物指标测定为主，步骤繁琐，操作费时，检测周期较长，如gc-ms法需要加入硅烷试剂衍生，干扰因素较多，无法满足多样品多指标快速准确测定的实际需求。水产品富含油脂、蛋白等干扰杂质，复杂基质对仪器检测分析造成干扰。


技术实现要素：

5.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
6.鉴于上述现有一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-ms/ms方法存在的问题，提出了本发明。
7.因此，本发明目的是提供一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-ms/ms方法，其所要解决的问题是以代谢物指标测定为主，步骤繁琐，操作费时，检测周期较长，另外如果加入硅烷试剂衍生，受干扰因素较大，无法满足多样品多指标快速准确测定的实际需求，而且水产品富含油脂、蛋白等干扰杂质，复杂基质对仪器检测分析造成干扰。
8.为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-ms/ms方法，其包括以下步骤：
9.步骤一：样品的提取
10.s1:准确称取5.0
±
0.2g匀浆后的样品，依次加入8-11ml丙酮-正己烷，0.7-1.3g氯
化钠，0.8-1.1g无水硫酸钠；
11.s2:将s1中处理的样品溶液涡旋振荡25-32s后置于水浴中超声辅助萃取9-13min，4000rpm离心5min取上清液至新管；
12.s3:再对s2中装有上清液的新管中加入上述丙酮-正己烷4-6ml重复萃取一次，4000rpm离心4-6min，合并上清液。
13.步骤二：样品溶液的净化
14.取5ml合并后的上清液加载于活化后的captiva emr-lipid(6ml，600mg)固相萃取小柱，保持流速约2ml/min，收集流出液，38℃-42℃下氮吹至近干，加入乙腈定容至0.7-1.3ml。
15.步骤三：采用液相色谱-串联质谱对样品溶液进行测试
16.其中，液相色谱条件为：
17.色谱柱为waters acquity uplc beh c18色谱柱，柱温33℃-36℃，进样量5μl，流动相a：0.1％甲酸水溶液(含2mmol乙酸铵)，流动相b：乙腈。梯度洗脱程序如下：0-1min，a:b＝70:30；1-2min，a:b＝50:50；2-5min，a:b＝5:95；5-10min，a:b＝5:95；10-11min，a:b＝70:30。
18.其中，质谱条件为：
19.干燥气温度：280℃-310℃；干燥气流量：(9-12l)/min；雾化气压力：40psi；毛细管电压：3500v；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：12l/min。
20.作为本发明所述一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-ms/ms方法的一种优选方案，其中：在s1中，加入的丙酮-正己烷为10ml，且丙酮和正己烷的v/v＝1:1。
21.作为本发明所述一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-ms/ms方法的一种优选方案，其中：在s1中，加入的氯化钠的重量为1g，加入的无水硫酸钠为1g。
22.作为本发明所述一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-ms/ms方法的一种优选方案，其中：在s2中，样品溶液涡旋振荡30s后置于水浴中超声辅助萃取10mi n。
23.作为本发明所述一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-ms/ms方法的一种优选方案，其中：在s3中，加入上述丙酮-正己烷5ml重复萃取一次，4000rpm离心5mi n。
24.作为本发明所述一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-ms/ms方法的一种优选方案，其中：对步骤二中的收集流出液，在40℃下氮吹至近干，加入乙腈定容至1ml。
25.作为本发明所述一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-ms/ms方法的一种优选方案，其中：步骤三中液相色谱条件的色谱柱柱温为35℃。
26.作为本发明所述一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-ms/ms方法的一种优选方案，其中：步骤三中质谱条件的干燥气温度为300℃；干燥气流量为10l/mi n。
27.综上所述，本发明包括以下至少一种有益效果：
28.本发明针对水产品基质特征，结合混合溶剂-超声辅助液液萃取和固相萃取净化
手段，建立水产品中多种bde-47代谢物的高通量uplc-ms/ms检测方法，具有快速、灵敏、准确的特点。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为本发明的所测代谢物的mrm谱图；
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.本发明实施例公开一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-msms方法。
33.实施例一
34.一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-ms/ms方法，包括以下步骤：
35.步骤一：样品的提取
36.s1:准确称取5.0
±
0.2g匀浆后的样品，依次加入8-11ml丙酮-正己烷，0.7-1.3g氯化钠，0.8-1.1g无水硫酸钠；
37.s2:将s1中处理的样品溶液涡旋振荡25-32s后置于水浴中超声辅助萃取9-13min，4000rpm离心5min取上清液至新管；
38.s3:再对s2中装有上清液的新管中加入上述丙酮-正己烷4-6ml重复萃取一次，4000rpm离心4-6min，合并上清液。
39.步骤二：样品溶液的净化
40.取5ml合并后的上清液加载于活化后的captiva emr-lipid(6ml，600mg)固相萃取小柱，保持流速约2ml/min，收集流出液，38℃-42℃下氮吹至近干，加入乙腈定容至0.7-1.3ml。
41.步骤三：采用液相色谱-串联质谱对样品溶液进行测试
42.其中，液相色谱条件为：
43.色谱柱为waters acquity uplc behc18色谱柱，柱温33℃-36℃，进样量5μl，流动相a：0.1％甲酸水溶液(含2mmol乙酸铵)，流动相b：乙腈。梯度洗脱程序如下：0-1min，a:b＝70:30；1-2min，a:b＝50:50；2-5min，a:b＝5:95；5-10min，a:b＝5:95；10-11min，a:b＝70:30。
44.其中，质谱条件为：
45.干燥气温度：280℃-310℃；干燥气流量：(9-12l)/min；雾化气压力：40psi；毛细管电压：3500v；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：12l/min。
46.上述步骤中的具体数值如下：在s1中，加入的丙酮-正己烷为8ml，且丙酮和正己烷的v/v＝1:1，加入的氯化钠的重量为0.7g，加入的无水硫酸钠为0.8g，在s2中，样品溶液涡旋振荡25s后置于水浴中超声辅助萃取9min，在s3中，加入上述丙酮-正己烷4ml重复萃取一次，4000rpm离心4min，对步骤二中的收集流出液，在38℃下氮吹至近干，加入乙腈定容至0.7ml，步骤三中液相色谱条件的色谱柱柱温为33℃，步骤三中质谱条件的干燥气温度为280℃；干燥气流量为9l/min。
47.实施例二
48.一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-ms/ms方法，包括以下步骤：
49.步骤一：样品的提取
50.s1:准确称取5.0
±
0.2g匀浆后的样品，依次加入8-11ml丙酮-正己烷，0.7-1.3g氯化钠，0.8-1.1g无水硫酸钠；
51.s2:将s1中处理的样品溶液涡旋振荡25-32s后置于水浴中超声辅助萃取9-13min，4000rpm离心5min取上清液至新管；
52.s3:再对s2中装有上清液的新管中加入上述丙酮-正己烷4-6ml重复萃取一次，4000rpm离心4-6min，合并上清液。
53.步骤二：样品溶液的净化
54.取5ml合并后的上清液加载于活化后的captiva emr-lipid(6ml，600mg)固相萃取小柱，保持流速约2ml/min，收集流出液，38℃-42℃下氮吹至近干，加入乙腈定容至0.7-1.3ml。
55.步骤三：采用液相色谱-串联质谱对样品溶液进行测试
56.其中，液相色谱条件为：
57.色谱柱为waters acquity uplc beh c18色谱柱，柱温33℃-36℃，进样量5μl，流动相a：0.1％甲酸水溶液(含2mmol乙酸铵)，流动相b：乙腈。梯度洗脱程序如下：0-1min，a:b＝70:30；1-2min，a:b＝50:50；2-5min，a:b＝5:95；5-10min，a:b＝5:95；10-11min，a:b＝70:30。
58.其中，质谱条件为：
59.干燥气温度：280℃-310℃；干燥气流量：(9-12l)/min；雾化气压力：40psi；毛细管电压：3500v；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：12l/min。
60.上述步骤中的具体数值如下：在s1中，加入的丙酮-正己烷为10ml，且丙酮和正己烷的v/v＝1:1，加入的氯化钠的重量为1g，加入的无水硫酸钠为1g，在s2中，样品溶液涡旋振荡30s后置于水浴中超声辅助萃取10min，在s3中，加入上述丙酮-正己烷5ml重复萃取一次，4000rpm离心5min，对步骤二中的收集流出液，在40℃下氮吹至近干，加入乙腈定容至1ml，步骤三中液相色谱条件的色谱柱柱温为35℃，步骤三中质谱条件的干燥气温度为300℃；干燥气流量为10l/min。
61.实施例三
62.一种同时测定水产品中多种四溴二苯醚代谢物的uplc-ms/ms方法，包括以下步骤：
63.步骤一：样品的提取
64.s1:准确称取5.0
±
0.2g匀浆后的样品，依次加入8-11ml丙酮-正己烷，0.7-1.3g氯化钠，0.8-1.1g无水硫酸钠；
65.s2:将s1中处理的样品溶液涡旋振荡25-32s后置于水浴中超声辅助萃取9-13min，4000rpm离心5min取上清液至新管；
66.s3:再对s2中装有上清液的新管中加入上述丙酮-正己烷4-6ml重复萃取一次，4000rpm离心4-6min，合并上清液。
67.步骤二：样品溶液的净化
68.取5ml合并后的上清液加载于活化后的captiva emr-lipid(6ml，600mg)固相萃取小柱，保持流速约2ml/min，收集流出液，38℃-42℃下氮吹至近干，加入乙腈定容至0.7-1.3ml。
69.步骤三：采用液相色谱-串联质谱对样品溶液进行测试
70.其中，液相色谱条件为：
71.色谱柱为waters acquity uplc beh c18色谱柱，柱温33℃-36℃，进样量5μl，流动相a：0.1％甲酸水溶液(含2mmol乙酸铵)，流动相b：乙腈。梯度洗脱程序如下：0-1min，a:b＝70:30；1-2min，a:b＝50:50；2-5min，a:b＝5:95；5-10min，a:b＝5:95；10-11min，a:b＝70:30。
72.其中，质谱条件为：
73.干燥气温度：280℃-310℃；干燥气流量：(9-12l)/min；雾化气压力：40psi；毛细管电压：3500v；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：12l/min。
74.上述步骤中的具体数值如下：在s1中，加入的丙酮-正己烷为11ml，且丙酮和正己烷的v/v＝1:1，加入的氯化钠的重量为1.3g，加入的无水硫酸钠为1.1g，在s2中，样品溶液涡旋振荡32s后置于水浴中超声辅助萃取13min，在s3中，加入上述丙酮-正己烷6ml重复萃取一次，4000rpm离心6min，对步骤二中的收集流出液，在42℃下氮吹至近干，加入乙腈定容至1.3ml，步骤三中液相色谱条件的色谱柱柱温为36℃，步骤三中质谱条件的干燥气温度为310℃；干燥气流量为12l/min。
75.通过对三种实施例不同步骤中数值的差距做出分析，得出实施例二中的数值为最佳数值，具体实施例二中的定量和定性离子对，如下表，表中*为定量离子。
[0076][0077]
另外实施例二中的6种代谢物在0.2-20ng/ml范围内的线性相关系数(r2)为0.996-0.999，线性相关性良好。由检出限0.1-0.3μg/kg，定量限0.3-0.9μg/kg，方法具有较高的灵敏度，具体表现如下表。
[0078][0079]
最后应说明的几点是：首先，在本技术的描述中，需要说明的是，除非另有规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通，可以是直接相连，“上”、“下”、“左”、“右”等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变，则相对位置关系可能发生改变；
[0080]
其次：本发明公开实施例附图中，只涉及到与本公开实施例涉及到的结构，其他结构可参考通常设计，在不冲突情况下，本发明同一实施例及不同实施例可以相互组合；
[0081]
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明
的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。