一种野烟叶药材的质量检测方法与流程

1.本发明涉及中药分析技术领域，特别是一种野烟叶药材的质量检测方法。


背景技术：

2.野烟叶药材为菊科植物烟管头草carpesiumcernuuml.或金挖耳carpesiumdivaricatumsieb.et zucc.的干燥全草。秋季结果前采收，除去杂质，干燥。
3.烟管头草多年生草本。茎高50-100厘米，下部密被白色长柔毛及卷曲的短柔毛，基部及叶腋尤密，常成棉毛状，上部被疏柔毛，后渐脱落稀疏，有明显的纵条纹，多分枝。基生叶开花前凋萎，稀宿存；茎下部叶较大，具长柄，柄长约为叶片的2/3或近等长，下部具狭翅，向叶基渐宽，叶片长椭圆形或匙状长椭圆形，长6-12厘米，宽4-6厘米，先端锐尖或钝，基部长渐狭下延，上面绿色，被稍密的倒状伏毛，下面淡绿色，被白色长柔毛，沿叶脉较密，在中肋及叶柄上常成绒毛状，两面均有腺点，边缘具稍不规整具胼胝尖的锯齿；中部叶椭圆形至长椭圆形，长8-11厘米，宽3-4厘米，先端渐尖或锐尖，基部楔形，具短柄；上部叶渐小，椭圆形至椭圆状披针形，近全缘。头状花序单生茎端及枝端，开花时下垂；苞叶多枚，大小不等，其中2-3枚较大，椭圆状披针形，长2-5厘米，两端渐狭，具短柄，密被柔毛及腺点，其余较小，条状披针形或条状匙形，稍长于总苞。总苞壳斗状，直径1-2厘米，长7-8毫米；苞片4层，外层苞片叶状，披针形，与内层苞片等长或稍长，草质或基部干膜质，密被长柔毛，先端钝，通常反折，中层及内层干膜质，狭矩圆形至条形，先端钝，有不规整的微齿。雌花狭筒状，长约1.5毫米，中部较宽，两端稍收缩，两性花筒状，向上增宽，管檐5齿裂。瘦果长4-4.5毫米。分布于东北、华北、华中、华东、华南及西南各省区及西北陕西、甘肃等地。
4.金挖耳多年生草本。茎直立，高25-150厘米，被白色柔毛，初时较密，后渐稀疏，中部以上分枝，枝通常近平展。基生叶于开花前凋萎，下部叶卵形或卵状长圆形，长5-12厘米，宽3-7厘米，先端锐尖或钝，基部圆形或稍呈心形，有时呈阔楔形，边缘具粗大具胼胝尖的牙齿，上面深绿色，被具球状膨大基部的柔毛，老时脱落稀疏而留下膨大的基部，叶面稍粗糙，下面淡绿色，被白色短柔毛并杂以疏长柔毛，沿中肋较密；叶柄较叶片短或近等长，与叶片连接处有狭翅，下部无翅；中部叶长椭圆形，先端渐尖，基部楔形，叶柄较短，无翅；上部叶渐变小，长椭圆形或长圆状披针形，两端渐狭，几无柄。头状花序单生茎端及枝端；苞叶3-5枚，披针形至椭圆形，其中2枚较大，较总苞长2-5倍，密被柔毛和腺点。总苞卵状球形，基部宽，上部少收缩，长5-6毫米，直径6-10毫米，苞片4层，覆瓦状排列，外层短(向内逐层增长)，广卵形，干膜质或先端稍带草质，背面被柔毛，中层狭长椭圆形，干膜质，先端钝，内层条形。雌花狭筒状，长1.5-2毫米，管檐4-5齿裂，两性花筒状，长3-3.5毫米，向上稍宽，管檐5齿裂，筒部在放大镜下可见极少数柔毛。瘦果长3-3.5毫米。分布于华东、华南、华中、西南、东北各省区。
5.本品亦为苗族习用药材。为菊科植物烟管头草carpesiumcernuuml.或金挖耳carpesium divaricatumsieb.etzucc.的干燥全草。秋季结果前采挖，除去杂质，干燥。(同《贵州省中药材民族药材质量标准》)。
6.野烟叶原标准中规定其基原为“烟管头草carpesiumcernuuml.或金挖耳carpesiumdivaricatum sieb.etzucc.的干燥全草”。“金挖耳”之名见于清《植物名实图考》记载，《大观本草》本草名“滁州鹤虱”；烟管头草别名也称“金挖耳”。该2种在我国分布广泛，其分布区域也大部相同，资源丰富。经查阅《中国中药资源志要》、《全国中草药汇编》及贵州、云南、四川、重庆、广西等地方有关中草药的文献，各地多将该2种同等入药，其功能主治也相似，故沿用原标准规定的基原植物。同时，苗族(窝英，野烟)、侗族(金却卡)、土家族(挖耳草、野烟)、彝族(娃勒波)、瑶族(骨坦咪)等民间也药用，故注明为苗族习用药材。
7.菊科植物烟管头草carpesiumcernuuml.及金挖耳carpesiumdivaricatumsieb.etzucc.在贵州、四川、重庆、云南、安徽、广西等民间均药用；药材名“野烟叶”之名见于《贵州省中药材民族药材质量标准》，贵州、云南、重庆等又称“挖耳草”，安徽、云南又称“烟袋草”等，苗族称“野烟”。故本标准中参照原标准，沿用“野烟叶”之名。
8.野烟叶属于菊科天名精属植物，该属植物含有萜类、甾体类、黄酮类、香豆素类、木脂素类、脂肪酸类等多种类型的化合物。然而，目前关于其化学成分研究大多集中在弱极性化合物，尤其是倍半萜类成分，其具有抑菌、细胞毒活性、除草活性等，而对其极性化合物研究较少，且原标准中也无含量测定规定。因此，亟需研发一种野烟叶药材的质量检测方法，从而能有效地控制野烟叶药材的整体质量、保证野烟叶药材临床用药的安全有效性。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于，一种野烟叶药材的质量检测方法，该质量检测方法包括野烟叶药材的显微鉴别特征和野烟叶药材中1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量测定方法，采用所述的质量检测方法，能够对药材的真伪进行准确鉴别；并能够准确、快速的测定出野烟叶药材中1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量，从而有利于对野烟叶药材的质量进行控制。采用所述的野烟叶药材的质量检测方法能有效地控制野烟叶药材的整体质量、保证野烟叶药材临床用药的安全有效性。
10.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
11.一种野烟叶药材的质量检测方法，包括鉴别和/或含量的测定项目；其中鉴别是对野烟叶药材的显微鉴别方法；含量测定是用高效液相色谱法测定野烟叶药材1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量。
12.前述的野烟叶药材的质量检测方法中，对野烟叶药材的显微鉴别方法包括根横切面、茎横切面、叶横切面、叶表面和粉末显微的鉴别。
13.(1)根横切面：类圆形。表皮由1层薄壁细胞组成，形状不规则，多破碎或脱落，偶见根毛。皮层宽广，细胞呈类长方形，内皮层不明显，近韧皮部有分泌腔断续排列成环。维管束外韧型，环列。束间形成层不明显，韧皮部细胞排列紧密，与木质部间有断续成环的裂隙，木质部细胞均木质化，导管多单个散在，木射线细胞由1～3列细胞组成。
14.(2)茎横切面：
15.烟管头草表皮由一列类圆形排列紧密的细胞组成，表皮可见非腺毛及少量腺毛。皮层较宽，由薄壁细胞组成，外侧有2～3列排列紧密的厚角组织。维管束外韧型，约20～30束呈环状排列；形成层不明显；韧皮部狭窄，外侧有纤维束，呈半月形；木质部由木纤维和导管组成，细胞壁木化。髓部发达，髓射线较窄，由2～8列径向延长的薄壁细胞组成；
16.金挖耳表皮毛少见；皮层狭窄，韧皮部外纤维束发达，髓部宽广；
17.(3)叶横切面：上表皮细胞由1列排列不规则的薄壁细胞组成，上、下表皮均被腺毛和非腺毛，其中非腺毛多由2至6个细胞组成，腺毛多单柄。叶肉组织与下表皮细胞分化不明显，无栅栏组织和海绵组织之分。主脉上、下表皮内为数列厚角组织，维管束双韧型，韧皮部呈两个半月形围绕木质部，木质部导管径向排列或散在。
18.(4)叶表面：上表皮细胞呈多角形，可见腺毛和非腺毛。下表皮细胞类多角形，垂周壁稍波状弯曲，气孔较多，呈不定式，密被腺毛和非腺毛。
19.(5)粉末显微：本品粉末呈黄绿色至灰绿色。导管多见，多为螺纹、网纹导管，偶见梯纹、孔纹导管，直径20～75μm。非腺毛多见，由2～4个细胞组成，稍弯曲，常破碎；腺毛少见，多为单细胞腺毛。木纤维多成束，长条形，末端平截，壁稍增厚。花粉粒少见，圆球形，直径18～25μm，表面有尖刺，具3个萌发孔。
20.前述的野烟叶药材的质量检测方法中，野烟叶药材中1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量测定方法，照高效液相色谱法测定，包括以下步骤：
21.(1)色谱条件与系统适用性试验：以intersilods-sp(4.6
×
150mm，5μm)为色谱柱；以乙腈-0.4％甲酸溶液(14:86)为流动相，检测波长为325nm。理论板数按1,5-二咖啡酰奎宁酸峰计算应不低于2500。
22.(2)对照品溶液的制备：取1,5-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每lml含24μg的溶液，即得。
23.(3)供试品溶液的制备：取本品粉末(过4号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
24.(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
25.(5)本品按干燥品计算，含1,5-二咖啡酰奎宁酸(c
25h24o12
)不得少于0.045％。
26.前述的野烟叶药材的质量检测方法中，超声处理的功率为250w，频率40khz。
27.本发明的有益效果为：
28.1、本发明提供了一种野烟叶药材的质量检测方法，该质量检测方法包括野烟叶药材的显微鉴别方法和野烟叶药材中1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量测定方法。所述的野烟叶药材的显微鉴别方法简便可行，能够对药材的真伪进行准确的鉴别。所述的野烟叶药材中1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量测定方法能够准确、快速的测定出野烟叶药材的含量，为野烟叶药材提供有效的定性定量分析手段，从而有利于对野烟叶药材的质量进行控制。采用本发明提供的野烟叶药材的质量检测方法能有效的控制野烟叶药材的整体质量、保证野烟叶药材临床用药的安全有效性。
29.本发明提供的艾纳香药材的质量检测方法，有助于弥补《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版：野烟叶)中质量检测方法的不足，实用性强。本发明方法对于野烟叶药材的进一步质量控制具有重要的意义，可为野烟叶药材质量表混的制定提供科学依据。
附图说明
30.图1是野烟叶根横切面组织(图中，a：烟管头草根横切面；b：金挖耳根横切面)；
31.图2是野烟叶茎横切面组织(图中，a：烟管头草茎横切面；b：金挖耳茎横切面)；
32.图3是野烟叶叶横切面组织(图中，a：烟管头草叶横切面；b：金挖耳叶横切面)；
33.图4是野烟叶叶表面观(图中，a：烟管头草叶表面观；b：金挖耳叶表面观)；
34.图5是野烟叶粉末特征(图中，a：导管，b：筛管、木纤维、非腺毛)；
35.图6是1,5-二咖啡酰奎宁酸质谱图(图中，a为野烟叶色谱图及tic图；b为野烟叶主要化学成分鉴定结果图；c为野烟叶主要化学成分主要离子碎片归属图)；
36.图7是样品紫外吸收图谱(a：1,5-二咖啡酰奎宁酸对照品；b：野烟叶药材)；
37.图8是样品纯度视图(a：1,5-二咖啡酰奎宁酸对照品；b：野烟叶药材)；
38.图9是对照品nmr图；
39.图10是1,5-二咖啡酰奎宁酸的标准曲线图；
40.图11是样品hplc图谱图(图中，a：1,5-二咖啡酰奎宁酸对照品；b：野烟叶药材)；
41.图12是intersilods-sp(4.6
×
150mm，5μm)对照品图谱图；
42.图13是intersilods-sp(4.6
×
150mm，5μm)样品图谱图；
43.图14是agilenteclipsexdb-c18(4.6
×
150mm，5μm)对照品图谱图；
44.图15是agilenteclipsexdb-c18(4.6
×
150mm，5μm)样品图谱图；
45.图16是柱温28℃的对照品检测报告图谱；
46.图17是柱温28℃的对照品hplc图谱；
47.图18是柱温28℃的样品hplc图谱；
48.图19是柱温32℃的对照品hplc图谱；
49.图20是柱温32℃的样品hplc图谱；
50.图21是流速0.8ml/min的对照品hplc图谱；
51.图22是流速0.8ml/min的样品hplc图谱；
52.图23是流速0.6ml/min的对照品hplc图谱-；
53.图24是流速0.6ml/min的样品hplc图谱；
54.图25是波长323nm的对照品hplc图谱；
55.图26是波长323nm的样品hplc图谱；
56.图27是波长327nm的对照品hplc图谱；
57.图28是波长327nm的样品hplc图谱；
58.图29是乙腈:0.4％甲酸溶液15:85的对照品hplc图谱；
59.图30是乙腈:0.4％甲酸溶液15:85的样品hplc图谱；
60.图31是乙腈:0.4％甲酸溶液13:87的对照品hplc图谱；
61.图32是乙腈:0.4％甲酸溶液13:87的样品hplc图谱；
62.图33是岛津lc-20a的对照品hplc图谱；
63.图34是岛津lc-20a的样品hplc图谱；
64.图35是岛津lc-2010cht的对照品hplc图谱；
65.图36是岛津lc-2010cht的样品hplc图谱；
66.图37是waterse2695的对照品hplc图谱；
67.图38是waterse2695的样品hplc图谱；
68.图39是色谱柱inertsilods-sps/n2ai92266的对照品hplc图谱；
69.图40是色谱柱inertsilods-sps/n2ai92266的样品hplc图谱。
具体实施方式
70.下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
71.实施例。本发明所述一种野烟叶药材质量检测方法，不限于以下实施例。
72.仪器：
73.waterse2695型高效液相色谱仪，岛津lc-20a型高效液相色谱仪，岛津lc-2010cht型高效液相色谱仪；
74.cpa225d型电子天平：十万分之一，sartorius；
75.bs224s型电子天平：万分之一，sartorius；
76.kq5200型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；
77.hh-4型数显恒温水浴锅：金坛市华欧实验仪器厂；
78.cs101-2ebn电热恒温鼓风干燥箱：重庆市永生实验仪器厂；
79.8-10型箱式电阻炉：中国沈阳市节能电炉厂制造；
80.zf-20d暗箱式紫外分析仪：巩义市予华仪器有限责任公司。
81.试剂与试药
82.1,5-二咖啡酰奎宁酸对照品(lot：prf10041043，成都普瑞法科技开发有限公司)。
83.药材
84.试验用共计15批野烟叶药材样品均由贵州百灵集团提供。经江西中医药大学钟国跃研究员鉴定为菊科植物为烟管头草carpesiumcernuuml.和金挖耳carpesiumdivaricatumsieb.etzucc.的干燥全草。样品信息见表1。
85.表1野烟叶药材样品信息一览表
[0086][0087]
对野烟叶药材的显微鉴别方法包括根横切面、茎横切面、叶横切面、叶表面和粉末显微的鉴别。
[0088]
(1)根横切面：类圆形。表皮由1层薄壁细胞组成，形状不规则，多破碎或脱落，偶见
根毛。皮层宽广，细胞呈类长方形，内皮层不明显，近韧皮部有分泌腔断续排列成环。维管束外韧型，环列。束间形成层不明显，韧皮部细胞排列紧密，与木质部间有断续成环的裂隙，木质部细胞均木质化，导管多单个散在，木射线细胞由1～3列细胞组成。如图1所示。
[0089]
(2)茎横切面：
[0090]
烟管头草表皮由一列类圆形排列紧密的细胞组成，表皮可见非腺毛及少量腺毛。皮层较宽，由薄壁细胞组成，外侧有2～3列排列紧密的厚角组织。维管束外韧型，约20～30束呈环状排列；形成层不明显；韧皮部狭窄，外侧有纤维束，呈半月形；木质部由木纤维和导管组成，细胞壁木化。髓部发达，髓射线较窄，由2～8列径向延长的薄壁细胞组成；如图2所示。
[0091]
金挖耳表皮毛少见；皮层狭窄，韧皮部外纤维束发达，髓部宽广；
[0092]
(3)叶横切面：上表皮细胞由1列排列不规则的薄壁细胞组成，上、下表皮均被腺毛和非腺毛，其中非腺毛多由2至6个细胞组成，腺毛多单柄。叶肉组织与下表皮细胞分化不明显，无栅栏组织和海绵组织之分。主脉上、下表皮内为数列厚角组织，维管束双韧型，韧皮部呈两个半月形围绕木质部，木质部导管径向排列或散在。图3所示。
[0093]
(4)叶表面：上表皮细胞呈多角形，可见腺毛和非腺毛。下表皮细胞类多角形，垂周壁稍波状弯曲，气孔较多，呈不定式，密被腺毛和非腺毛。如图4所示。
[0094]
(5)粉末显微：本品粉末呈黄绿色至灰绿色。导管多见，多为螺纹、网纹导管，偶见梯纹、孔纹导管，直径20～75μm。非腺毛多见，由2～4个细胞组成，稍弯曲，常破碎；腺毛少见，多为单细胞腺毛。木纤维多成束，长条形，末端平截，壁稍增厚。花粉粒少见，圆球形，直径18～25μm，表面有尖刺，具3个萌发孔。如图5所示。
[0095]
本研究中，用50％乙醇提取，分别用乙酸乙酯和正丁醇萃取，采用hplc-ms对正丁醇部位特征性化合物成分进行分析，发现咖啡酰奎宁酸类为其主要成分，其中之一为1,5-二咖啡酰奎宁酸(图6-10)。
[0096]
【含量测定】原标准中无含量测定规定。
[0097]
有研究表明，咖啡酰奎宁酸类化合物具有抗炎、抗氧化、细胞损伤保护、抗纤维化等药理活性，1,5-二咖啡酰奎宁酸具有较强的细胞保护作用。故，本次标准修订中选择以1,5-二咖啡酰奎宁酸为指标成分，研究建立了其含量测定方法，并规定了其含量限量。
[0098]
照高效液相色谱法(《中国药典》2015版第四部通则0512)测定。测定方法如下：
[0099]
供试品溶液：取本品粉末(过4号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0100]
对照品溶液的制备取1,5-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每lml含24μg的溶液，即得。
[0101]
色谱条件以intersilods-sp(4.6
×
150mm，5μm)为色谱柱；以乙腈-0.4％甲酸溶液(14:86)为流动相，检测波长为325nm。理论板数按1,5-二咖啡酰奎宁酸峰计算应不低于2500。
[0102]
1检测波长的选择
[0103]
岛津lc-20a型高效液相色谱仪，色谱柱为inertsilods-sp(4.6mm
×
150mm,5μm)，流动相：乙腈-0.4％甲酸溶液(14:86)，柱温：30℃，流速：0.7ml/min，检测波长：325nm。上述
色谱条件下，1,5-二咖啡酰奎宁酸达到良好分离，理论塔板数均》2500。
[0104]
本品含咖啡酰奎宁酸类化合物较多，对色谱柱的选择性较高。其中以intersilods-sp(4.6
×
150mm，5μm)色谱柱对1,5-二咖啡酰奎宁酸能达到基线分离，而其他色谱柱如agilenteclipsexdb-c18(4.6
×
150mm，5μm)等色谱柱不能达到基线分离，目标峰与前面的杂质峰混在一起，表明此类化合物对色谱柱要求较高。本研究中，选择使用intersilods-sp(4.6
×
150mm，5μm)色谱柱，该种色谱柱有市售，且价格适中。
[0105]
中国食品药品检定研究院无1,5-二咖啡酰奎宁酸对照品出售，本次研究所用的对照品为市售对照品，购自成都普瑞法科技开发有限公司，hplc归一化法检测其纯度为98.80％(非intersilods-sp(4.6
×
150mm，5μm)色谱柱)；采用本文色谱条件进行纯度检测，为93.33％，再次验证了该化合物对色谱柱要求苛刻。本次实验按含量为93.33％计。如图10-15所示。
[0106]
2对照品溶液的配制
[0107]
精密称取1,5-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，用70％甲醇制成每1ml含有1,5-二咖啡酰奎宁酸194.1μg对照品的储备液，置4℃冰箱中避光保存，备用。取对照品储备液稀释8倍，即制成每1ml含1,5-二咖啡酰奎宁酸24.3μg，作为对照品溶液。
[0108]
3供试品溶液制备方法考察
[0109]
3.1提取溶剂考察
[0110]
取野烟叶药材(批号：20161011)粗粉(过4号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇各25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用各溶剂补足减失的重量，摇匀，离心，滤过，即得。取各样品20μl进样，计算1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量，结果见表2。由结果可知，以70％甲醇为溶媒的提取液中1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量较高，故选择以70％甲醇为溶媒。
[0111]
表2溶媒考察结果
[0112][0113]
3.2溶媒用量考察
[0114]
取野烟叶药材(批号：20161011)粗粉(过4号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇各25ml、50ml、100ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，滤过，即得。取各样品20μl进样，计算1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量，结果见表3。由结果可知，溶媒用量对1,5-二咖啡酰奎宁酸提取率的影响不大，为节约溶剂，故选择溶媒用量为25ml。
[0115]
表3溶媒用量考察结果
[0116]
[0117]
3.3超声时间考察
[0118]
取野烟叶药材(批号：20161011)粗粉(过4号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，分别超声处理15、30、40分钟，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，滤过，即得。取各样品20μl进样，计算1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量，结果见表4。由结果可知，随着超声时间增加，1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量也相应的增加，超声处理30分钟和45分钟，1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量相差不大，故确定超声时间为30分钟。
[0119]
表4超声时间考察结果
[0120][0121]
根据上述试验结果供试品溶液制备方法为：取本品粉末(过4号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0122]
4方法学验证
[0123]
4.1线性关系考察
[0124]
取混合对照品储备稀释一定倍数，取混合对照品及其各稀释液进样。以进样量对峰面积积分值进行线性回归处理，得1,5-二咖啡酰奎宁酸的回归方程。结果表明1,5-二咖啡酰奎宁酸在此条件下线性良好，结果见表5，标准曲线见图10。
[0125]
表51,5-二咖啡酰奎宁酸的回归方程及线性范围
[0126][0127]
综合上述方法学考察结果，确定供试品溶液制备方法为：称取药材粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％乙醇25ml，称重，超声30min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。
[0128]
4.2耐用性考察
[0129]
取野烟叶药材粗粉(20161106)，按“供试品制备方法”制备供试品溶液，考察柱温、流速、流动相比例、波长、色谱仪、色谱柱对含量测定方法的影响，结果见表6。由结果可知，微调柱温、流速、流动相比例、波长及不同的色谱仪、同型号色谱柱对含量测定结果影响较小。
[0130]
表6耐用性考察结果
[0131][0132]
4.3检测限和定量限的测定
[0133]
配制一个较低浓度的对照品溶液，注入液相色谱仪，观察其峰高比基线噪音高多少倍(即s/n)，当s/n约等于3时，此时的浓度为检测限，当s/n约等于10时，此时的浓度为定量限，结果见表7。
[0134]
表71,5-二咖啡酰奎宁酸的检测限及定量限
[0135][0136]
4.4精密度试验
[0137]
取混合对照品溶液，连续进样6次，每次20μl，记录1,5-二咖啡酰奎宁酸的峰面积，结果见表8。结果表明1,5-二咖啡酰奎宁酸在此条件下精密度良好。
[0138]
表8精密度测定结果(按峰面积积分值计)
[0139][0140][0141]
4.5重复性试验
[0142]
取野烟叶药材(批号：20150121)，按“供试品溶液制备方法”项下制备供试溶液品6份，进样20μl，测定1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量，结果见表9。结果表明野烟叶在此条件下重复性良好。
[0143]
表9重复性试验测定结果(平均含量，mg/g)
[0144][0145]
4.6溶液稳定性试验
[0146]
取野烟叶药材(批号：20150121)，按“供试品溶液制备方法”项下制备供试品溶液，分别于0，4，8，12，24h进样，每次20μl，记录1,5-二咖啡酰奎宁酸的峰面积，结果见表10。结果表明处理后的样品在1d内稳定。
[0147]
表10稳定性测定结果(按峰面积积分值计)
[0148][0149]
4.7加样回收率
[0150]
精密称取野烟叶药材(批号：20150121)约0.5g，加入储备液2ml，按“供试品溶液制备方法”项下制备样品6份，测定1,5-二咖啡酰奎宁酸含量，计算加样回收率。1,5-二咖啡酰奎宁酸的平均回收率及rsd％见表11。rsd％≤2.0％，表示测定结果准确。数据符合2015版《中国药典》第四部9101项下方法学验证要求(待测成分含量为0.1％，相应回收率限度为90％-108％)。
[0151]
表11野烟叶的加样回收率测定结果(n＝6)
[0152][0153]
5样品含量测定
[0154]
取15批次野烟叶药材，按“供试品溶液制备方法”项下制备供试品溶液，按“色谱条件”项下，测定各样品的1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量，结果见表12。
[0155]
表12野烟叶药材中含量测定结果
[0156][0157][0158]
*为离群值。
[0159]
为防止测定结果出现远离均值的极端值，采用统计方法中的g检验法对测定值进
行检验，剔除离群值(6号样品)，计算其余样品测定的平均值为0.706mg/g。
[0160]
结果表明，15批药材样品中1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量在0.346～3.475mg/g之间，剔除离群值的平均值为0.706mg/g取均值下浮30％为0.4942mg/g，15批样品中有4批不合格，合格率为74％。各样品中1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量变动范围较大，可能与样品中多种二咖啡酰奎宁酸类成分之间存在转化相互有关。综合考虑，确定1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量限量为不得低于0.045％。
[0161]
图12中的读值如表13所示，
[0162]
表13
[0163][0164]
图13中的读值如表14所示，
[0165]
表14
[0166][0167]
图14中的读值如表15所示，
[0168]
表15
[0169][0170]
图15中的读值如表16所示，
[0171]
表16
[0172][0173]
图17中的读值如表17所示，
[0174]
表17
[0175][0176]
图18中的读值如表18所示，
[0177]
表18
[0178][0179]
图19中的读值如表19所示，
[0180]
表19
[0181][0182]
图20中的读值如表20所示，
[0183]
表20
[0184][0185]
图21中的读值如表21所示，
[0186]
表21
[0187][0188]
图22中的读值如表22所示，
[0189]
表22
[0190][0191]
图23中的读值如表23所示，
[0192]
表23
[0193][0194]
图24中的读值如表24所示，
[0195]
表24
[0196][0197]
图25中的读值如表25所示，
[0198]
表25
[0199][0200]
图26中的读值如表26所示，
[0201]
表26
[0202]
[0203]
图27中的读值如表27所示，
[0204]
表27
[0205][0206]
图28中的读值如表28所示，
[0207]
表28
[0208][0209]
图29中的读值如表29所示，
[0210]
表29
[0211][0212]
图30中的读值如表30所示，
[0213]
表30
[0214][0215]
图31中的读值如表31所示，
[0216]
表31
[0217][0218]
图32中的读值如表32所示，
[0219]
表32
[0220][0221]
图33中的读值如表33所示，
[0222]
表33
[0223][0224]
图34中的读值如表34所示，
[0225]
表34
[0226][0227]
图35中的读值如表35所示，
[0228]
表35
[0229][0230]
图36中的读值如表36所示，
[0231]
表36
[0232][0233]
图37中的读值如表37所示，
[0234]
表37
[0235][0236]
图38中的读值如表38所示，
[0237]
表38
[0238][0239]
图39中的读值如表39所示，
[0240]
表39
[0241][0242]
图40中的读值如表40所示，
[0243]
表40
[0244]