一种基于双谐振压电技术鉴别细胞焦亡与凋亡的细胞力学方法

本发明牵涉一种基于双谐振压电技术鉴定焦亡与凋亡的方法，是基于石英晶体微天平技术原理，通过实时、动态监测粘附于at切、bt切双切型石英晶体表面的、无明显细胞-细胞间相互作用的hela和huvecs细胞群在焦亡、凋亡过程中产生的力学响应变化而建立的一种鉴定细胞焦亡、凋亡的细胞力学新方法。

背景技术：

1、细胞死亡，作为细胞生命的终点和生物机体中重要的保护机制，参与到许多生命活动中。其中，程序性死亡是一种由遗传调控的常见细胞死亡形式。凋亡，作为一种程序性死亡机制，与许多疾病的发生、发展息息相关，包括心血管疾病,如心衰、动脉粥样硬化，癌症等。然而目前，癌细胞对药物诱导的凋亡逃逸现象逐渐增加，使得肿瘤干预治疗反应不佳，而焦亡则为临床解决肿瘤干预治疗反应不佳提供了可能性，并表现出有潜力成为绕过细胞凋亡而激活肿瘤特异性免疫反应的有效手段。且焦亡也是触发心血管疾病的原因，在心血管疾病发病机制中起着重要作用。然而，细胞焦亡和凋亡引起的生物学功能及响应却截然不同，且影响疾病的不同进展，故使用合适的方法鉴别细胞焦亡和凋亡于药效评估及新药开发领域具有不可或缺的意义。

2、目前用以鉴别细胞焦亡和凋亡的技术主要基于细胞焦亡和凋亡的形态学、激活途径、生化产物差异。基于形态学差异的光学检测方法操作简单、直接但鉴定标准相对主观且只能在同一时间内观测极小部分区域内的细胞死亡，无法进行定量测定。而基于生化产物和激活路径差异的检测方法具有可定量或半定量测定的优势，如通过western blot、elisa、免疫荧光技术等检测细胞凋亡、焦亡发生的关键蛋白表达，或通过dna凝胶电泳、rt-qpcr、tunel技术等检测基因标记物等，此类方法检测结果更精准，但此类方法都是基于终点测试且容易产生假阳性结果。而目前应用最为广泛的检测不同细胞死亡方式的流式细胞仪，价格昂贵且操作不易上手，需要专业培训的人员进行操作，且流式细胞仪技术检测仍然是非实时性的。因此，一种能够同时满足实时、无损、高灵敏度、且操作简单的鉴别细胞死亡方式的技术是目前该领域所亟需的。

3、近年，细胞力学技术已应用于细胞死亡方式检测领域中，如原子力显微镜(atomicforce microscopy,afm)、牵引力显微镜(traction force microscopy,afm)等。但该类技术的检测方式仍然是基于终点测试，既无法动态、实时地获取细胞在死亡过程中的力学信息，也无法避免测定过程对细胞自然生理状态的干扰，影响检测的准确性和有效性。此外，该类技术多应用于单细胞死亡方式的检测。而本技术提供了一种能实时测定且不影响细胞生理状态的鉴定细胞群死亡方式的细胞力学方法，通过细胞对石英晶体施加的表面应力变化鉴别细胞焦亡和凋亡，建立以实时、无损的方式鉴别细胞凋亡、焦亡的细胞力学模型，这一优势于新药开发及药效评估领域的应用具有十分重要的帮助。

技术实现思路

1、本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种基于双谐振压电技术鉴别细胞焦亡与凋亡的细胞力学方法。

2、为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

3、所述基于双谐振压电技术鉴别细胞焦亡与凋亡的细胞力学方法包括如下步骤：

4、(1)将at切与bt切石英晶体置于检测池内，所述at切石英晶体与bt切石英晶体具有相同基础频率、表面形态和一致的表面粘附分子修饰；

5、(2)加入细胞，待细胞稳定粘附石英晶体界面后(12小时)，向检测池内加入脂多糖(lipopolysaccharide,lps)和霍乱毒素b亚单位(cholera toxin subunit b,ctb)以诱导细胞焦亡，及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,tnf-α)和环己酰亚胺(cycloheximide,chx)以诱导细胞凋亡，全程实时监测at切、bt切石英晶体的频率、电阻变化；优选地，向检测池内共加入40μl脂多糖和20μl霍乱毒素b亚单位以诱导细胞焦亡，或共加入40μl肿瘤坏死因子α和20μl环己酰亚胺以诱导细胞凋亡；

6、(3)通过如下公式测定细胞对石英晶体产生的表面应力(δs)：

7、

8、其中，kat＝2.75×10-12cm2 dyn-1，kbt＝-2.65×10-12cm2 dyn-1分别为at切、bt切石英晶体的应力系数；tqat和tqbt分别为以cm单位的石英晶体厚度；f0at＝f0bt＝9mhz是石英晶体谐振器的原始谐振频率；δftat和δftbt是在t时刻谐振器经历表面应力产生的新频移影响减去相应f0后的频移；

9、(4)通过如下公式测定细胞的存储模量(g′)与损耗模量(g″):

10、

11、

12、其中，γ为半带宽，ρc为细胞密度，基于其与纯水密度一致的假设：ρ水＝1.00g/cm3，其中zq为石英晶体的声阻抗，zqat＝8.84*105g/cm·s,zqbt＝1.35*106g/cm·s，ρc＝0.9933g/cm3；半带宽γ与动态电阻r之间存在如下关系：δγ＝δr/4πlq，其中lq为石英晶体在细胞培养基中的电感；

13、(5)根据细胞焦亡和凋亡过程中δs变化差异鉴别细胞焦亡和凋亡，并同时获得细胞焦亡和凋亡过程中细胞粘弹性变化。

14、下面对本发明作进一步说明：

15、本发明在不影响细胞功能的情况下，同时使用at切、bt切双切型石英晶体芯片，实时、长期监测hela和huvecs细胞群在焦亡和凋亡过程中对石英晶体施加的表面应力(δs)及细胞群存储模量(g′)和损耗模量(g″)的动态变化，并根据细胞对石英晶体施加的表面应力(δs)差异鉴别细胞焦亡和凋亡。at切与bt切石英晶体谐振器具有相同的应力系数大小，但是符号相反。细胞对石英晶体施加的应力变化可根据两谐振器对同一界面过程的不同频移变化来计算，故这一技术的基本前提在于保证监测过程at切、bt切石英晶体表面的质量变化、溶液粘性、及电极粗糙度一致。基于此必要充分条件，根据横向应力在at切和bt切石英晶体上产生的不同响应计算出应力的大小及方向。

16、本发明采用100nm厚度金镀层厚度的9mhz石英晶体双切型谐振器、适配的特氟隆检测池，搭载四通道石英晶体微天平网络分析仪250b动态监测细胞在焦亡和凋亡过程中的力学响应变化。用于测量的石英晶体谐振器芯片直径为12.5mm，金电极镀层直径为5mm。

17、具体来说，所述基于双谐振压电技术鉴别细胞焦亡与凋亡的细胞力学方法如下：

18、将at切、bt切石英晶体置于检测池内，所述at切与bt切石英晶体具有相同频率、表面状态和/或修饰了相同的表面粘附分子。向培养皿或检测池中加入待测细胞，通过如下公式测定出细胞牵引力：

19、

20、式中，kat＝2.75×10-12cm2 dyn-1，kbt＝-2.65×10-12cm2 dyn-1分别为at切、bt切石英晶体的应力系数；tqat和tqbt分别为以cm单位的石英晶体厚度；f0at＝f0bt＝9mhz是石英晶体谐振器的原始谐振频率；δftat和δftbt是在t时刻谐振器经历表面应力产生的新频移影响减去相应f0后的频移。

21、上述值代入公式(1)，可简化为：

22、δs＝380.8δfat-582.2δfbr  (2)

23、据公式(2)所求δs单位为dyne/cm,δs>0对应粘附于石英晶体表面的细胞群整体处于张应力状态，即细胞在铺展、粘附过程中通过粘着斑复合物对底部基质施加收缩牵引力的过程，此过程使得石英晶体受到压应力，δs呈正值；当δs<0对应粘附于石英晶体表面的细胞群整体处于压应力状态，即与收缩牵引力相反方向的突出力占主导，使得石英晶体受到张应力，δs呈负值。

24、此外，由于石英晶体的工作频率在兆赫兹级别，其厚度剪切波的衰减长度远小于细胞厚度，活细胞可以看作是半无限粘弹性载荷。故可通过如下公式测定出细胞粘弹性模量：

25、

26、

27、式中，zqat＝8.84*105g/cm·s,zqbt＝1.35*106g/cm·s分别为at切、bt切石英晶体的声阻抗；ρc＝0.9933g/cm3为细胞密度，假设细胞密度与纯水密度相同；lq为所测石英晶体的动态电感；f0at＝f0bt＝9mhz是石英晶体谐振器的原始谐振频率。δf、δf分别为石英晶体表面均匀粘弹性层相较于空气而引起的频移和动态电阻。

28、已知培养基引起的9mhz at和bt切上的频移和电阻为：

29、

30、横向应力在at切和bt切上引起的频移为：

31、

32、

33、故用总频移减去由横向应力引起的频移，可得由细胞粘弹性引起的频移为：

34、

35、

36、综上，用细胞粘弹性引起的频移和动态电阻减去培养基引起的频移和动态电阻，可得校正后的频移(δf)和动态电阻(δr)：

37、

38、

39、

40、

41、将公式(9-12)及lat＝10.7*10-3h，lbt＝40.1*10-3h代入公式(3)、(4)计算可得：

42、g′(at)＝0.5297δr2-0.009576δf2  (13)

43、g″(at)＝-0.1425δfδr  (14)

44、g′(bt)＝0.0879δr2-0.02233δf2  (15)

45、g″(bt)＝-0.08868δfδr  (16)

46、通过本发明的方法，可对焦亡和凋亡过程中的细胞产生的力与细胞粘弹性响应进行实时、同时、定量、连续的测定，并根据细胞对石英晶体施加的表面应力响应差异辨别焦亡和凋亡。当细胞稳定粘附于石英晶体表面上时，细胞在牵引力的主导下使石英晶体受到压应力，此时δs为正值。当细胞发生焦亡时，石英晶体受到的压应力转变为张应力，即细胞以与牵引力方向相反的突出力为主导，δs由正值转变为负值；而当细胞发生凋亡时，石英晶体受到的压应力进一步增大，细胞仍以牵引力为主导，对石英晶体施加的力方向不发生改变，δs仍为正值。