一种禽传染性支气管炎病毒nsp4ELISA抗体检测试剂盒及其应用

一种禽传染性支气管炎病毒nsp4 elisa抗体检测试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及免疫学检测方法领域，特别是涉及一种禽传染性支气管炎病毒nsp4 elisa抗体检测试剂盒及其应用。


背景技术：

2.禽传染性支气管炎(infectious bronchitis，ib)是由禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,ibv)引起的影响家禽养殖的重要疾病之一，能造成鸡死亡，蛋鸡产蛋量下降，肉鸡饲料转化率降低，具有极强的传染性，为我国二类动物疫病。ibv基因组编码的蛋白包括结构蛋白、非结构蛋白(non-structural protein,nsp)以及辅助蛋白。其中ibv具有15个非结构蛋白(nsp2-16)。ibv基因组容易发生变异导致其血清型众多，不同血清型之间交叉保护力弱，给本病诊断和防制带来很大的困难。
3.目前，针对ibv进行的鉴别诊断有病毒分离鉴定、血清学诊断、分子生物学诊断等主要的诊断方法。血清学检测方法中，elisa因具有快速、简便、准确、特异的特点被广泛采用并已被世界动物卫生组织(oie)确定为标准方法。李敏针对ibv m蛋白建立了双抗体夹心elisa方法；王新针对n蛋白建立了间接elisa方法用以检测ib抗体；王建忠等针对m41株s1蛋白原核表达后建立间接elisa方法。除了针对结构蛋白建立elisa方法外，针对辅助蛋白及非结构蛋白也有相关方法的建立，戴旭针对ibv辅助蛋白5b建立间接elisa方法；雷静针对nsp5蛋白建立了间接elisa方法，与ifa以及商品化试剂盒比较其灵敏度和准确度都很不错。elisa方法操作简单、成本低廉，适用于鸡群大规模筛查及免疫效果评价。常用的elisa方法有间接法和夹心法，夹心法比较适合于检测病料和尿囊液中的ibv，但病毒含量达到toc半数感染量为10-5
时方能够检出，对样品的要求较高。间接法更适用于抗体的检测，其方法相对于夹心法来说更为简便，容易操作，更能应用于大量样品的抗体筛查。
4.当前ibv商品化idexx抗体检测试剂盒采用m41全病毒粒子包被，但目前m41不是优势流行毒株，其对不同血清型的地方毒株的交叉反应性差异较大，加上活病毒纯化困难且存在散播病毒的危险性及检测成本高，无法区分灭活疫苗免疫和野毒感染，使得商品化ibv抗体检测试剂盒的应用受到限制。国内其它团队研发的elisa试剂盒多使用n蛋白进行包被，其检测的抗体为群特异性抗体，也无法区分灭活疫苗免疫和野毒感染。非结构蛋白结构和功能都极为稳定，且并不结合生成成熟的病毒，不参与病毒粒子的组成，针对非结构蛋白建立间接elisa具有区分灭活疫苗免疫和ibv活毒感染的潜力。
5.目前，尚未有利用ibv的非结构蛋白4作为检测抗原的血清学检测方法的报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种禽传染性支气管炎病毒nsp4 elisa抗体检测试剂盒及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该试剂盒以ibv非结构蛋白4为包被抗原，成本低，并且具有使用方便快捷、敏感性高、特异性好等优点，为ibv抗体监测、流行病学调查以
及将来对ibv的疾病净化提供了一种新的有效的检测手段。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明提供一种禽传染性支气管炎病毒nsp4 elisa抗体检测试剂盒，所述试剂盒以禽传染性支气管炎病毒重组非结构蛋白4(ibv nsp4)为包被抗原。
9.进一步地，所述禽传染性支气管炎病毒重组非结构蛋白4的编码基因核苷酸序列如seq idno：3所示，其氨基酸序列如seq id no：2所示。
10.进一步地，所述包被抗原的制备方法包括如下步骤：
11.将禽传染性支气管炎病毒重组非结构蛋白4的编码基因与原核表达载体连接，并转化至宿主菌中诱导表达，获得菌液，之后进行超声破碎和纯化，收获所述包被抗原。
12.进一步地，所述原核表达载体为pczn-1，所述宿主菌为大肠杆菌。
13.进一步地，还包含酶标二抗、封闭液、洗涤液、稀释液、阳性对照样品、阴性对照样品、显色液和终止液。
14.进一步地，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡igg抗体(hrp标记的goat anti-mouse igg)；所述阳性对照样品为抗禽传染性支气管炎病毒重组非结构蛋白4鸡血清，所述阴性对照样品为阴性鸡血清。
15.进一步地，所述封闭液为含5％脱脂奶粉的pbs；所述洗涤液为含0.1％tween-20的pbs；所述稀释液为含bsa和脱脂奶粉的pbst；所述显色液为tmb单组分显色液；所述终止液为2m h2so4。
16.本发明还提供一种禽传染性支气管炎病毒抗体的elisa检测方法，包括以下步骤：
17.(1)包被抗原：将权利要求1所述的禽传染性支气管炎病毒重组非结构蛋白4包被至酶标板；
18.(2)封闭：加入封闭液封闭1-2h；
19.(3)一抗孵育：用稀释液稀释血清，将稀释后的血清孵育30-60min；
20.(4)二抗孵育：加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡igg抗体，孵育30-60min；
21.(5)显色：加入显色液，37℃避光显色5-20min；
22.(6)终止：加入终止液终止显色；
23.(7)结果判定：用酶标仪测定450nm波长下的od值。
24.进一步地，在步骤(1)中，在步骤(1)中，所述禽传染性支气管炎病毒重组非结构蛋白4的包被浓度为0.25-2μg/ml；在步骤(2)中，所述封闭的时间为2h；在步骤(3)中，所述一抗的稀释度为1：50-1：500，孵育时间为30min；在步骤(4)中，所述二抗的稀释度为1：2000-1：8000，孵育时间为45min；在步骤(5)中，所述显色的时间为10min。
25.进一步地，在步骤(7)中，若待测血清的od值大于或者等于0.134，则为阳性，反之即为阴性。
26.本发明还提供一种所述的试剂盒在检测禽传染性支气管炎病毒抗体中的应用。
27.本发明公开了以下技术效果：
28.本发明成功建立了ibv nsp4抗体间接elisa检测方法，该方法特异性高，敏感性强，重复性好，批内重复性变异系数为4.6％，批间重复性变异系数均不超过7％。
29.本发明应用建立的间接elisa方法对临床以及人工感染ibv的共400份血清样品进
行检测，阳性率为93.75％；与idexx ibv抗体检测试剂盒符合率为95.6％，kappa值为0.815，一致性高。该方法可应用于大规模血清样品的检测，为ibv的血清学诊断和免疫监测提供了一个新的选择方法，具有良好的推广应用前景。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1为抗原表位预测结果；
32.图2为亲水性疏水性预测结果；
33.图3为重组nsp4蛋白表达与纯化；m.protein marker，1.未诱导，2.诱导沉淀，3.诱导上清，4.过柱流出液，5.洗涤液，6.蛋白洗脱液。
具体实施方式
34.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
35.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
36.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
37.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
38.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
39.本发明所使用的材料、仪器及试剂如无特殊说明，均可由商业途径获得；所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规实验方法。
40.1试验方法
41.1.1ibv nsp4蛋白表达载体的构建和表达
42.根据ncbi上公布的beaudette株(登录号m95169.1)的nsp4核苷酸序列应用在线分析软件iedb analysis resource(http://www.tools.iedb.org/main/)的表位预测及分析工具进行b细胞抗原表位预测(图1)，应用dnastar软件进行亲水性疏水性预测(图2)，选取
70℃保存，即为ibv nsp4阴性血清。
54.3间接elisa方法的优化
55.3.1间接elisa的操作步骤
56.(1)抗原包被：使用纯化的重组nsp4蛋白作为抗原用包被缓冲液稀释到一定浓度后加到酶标板中，每孔100μl，37℃湿盒2个小时后放入4℃冰箱包被过夜。之后用洗涤液(pbst)洗涤3次，每孔加洗涤液200μl，3min/次。除去未结合的抗原和杂质。
57.(2)封闭：将板内的液体拍净后，每孔加5％脱脂奶粉封闭液200μl，37℃湿盒封闭2h，弃去液体，同上洗涤(去除特异性)3次；
58.(3)加一抗：待测血清按一定浓度稀释后，每孔加入100μl，同时设置ibv nsp4阳性血清为阳性对照品、ibv nsp4阴性血清为阴性对照品；37℃湿盒45min，同上洗涤3次；
59.(4)加二抗(hrp标记的goat anti-mouse igg)：二抗用pbst稀释到一定浓度后，每孔加入100μl，37℃湿盒45min，同上洗涤3次；
60.(5)加底物显色：每孔加100μl tmb显色液，37℃湿盒避光显色15min；
61.(6)终止反应：每孔加入50μl终止液以结束反应；
62.(7)测值：用酶标仪在450nm波长下读取吸光度(od值)。
63.以ibv nsp4阳性血清为阳性对照，记为p值，ibv阴性血清为阴性，记为n值，进行间接elisa，通过对实验数据的处理，计算p/n值，以p/n值最大作为判定间接elisa反应的最佳条件。
64.3.2最佳包被浓度和一抗检测浓度的优化摸索
65.将纯化后的nsp4蛋白作为抗原，用包被缓冲液依次稀释为0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml，每孔加入100μl，37℃湿盒2h后4℃冰箱放置过夜。洗涤去除非特异性结合后封闭，然后将阳性对照血清作1:50、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500倍稀释加于酶标板中，按步骤进行，操作完成后于酶标仪上读取od
450 nm
值，计算分析得出最佳抗原包被浓度和一抗检测浓度。
66.3.3酶标二抗最佳检测浓度的优化摸索
67.按照最佳抗原包被浓度和一抗检测浓度进行试验，分别将二抗作1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:8000倍稀释，操作完成后于酶标仪上读取od
450 nm
值，计算分析得出最佳酶标二抗检测浓度。
68.3.4一抗最佳孵育时间的优化摸索
69.按照最佳的抗原包被浓度和一抗检测浓度、酶标二抗最佳检测浓度进行试验，一抗分别孵育30min、45min和60min，酶标仪上读取od
450 nm
值后计算分析得出最佳一抗孵育时间。
70.3.5酶标二抗最佳孵育时间的优化摸索
71.按照最佳的抗原包被浓度、一抗检测浓度、一抗孵育时间和酶标二抗检测浓度进行试验，孵育二抗的时间分别按照30min、45min和60min进行，于酶标仪上读取od
450 nm
值后计算分析得出最佳二抗孵育时间。
72.3.6最佳封闭时间的优化摸索
73.按照最佳的抗原包被浓度进行包被，封闭时间分别为1h、2h进行，封闭完再按照最佳的一抗检测浓度、一抗孵育时间、二抗检测浓度和最佳二抗孵育时间进行试验，于酶标仪
上读取od
450 nm
值后计算分析得出最佳封闭时间。
74.3.7最佳显色时间的优化摸索
75.按照最佳的抗原包被浓度、封闭时间、一抗检测浓度、一抗孵育时间、二抗检测浓度和二抗孵育时间进行试验，显色时间分别按照5min、10min、15min和20min进行，于酶标仪上读取od
450 nm
值后计算分析得出最佳显色时间。
76.3.8阴阳临界值的确定
77.取50份ibv阴性血清，按照试验摸索得出的最佳条件进行elisa反应，根据50个血清样品的od
450 nm
值，计算出平均值(x)和标准方差(sd)，阴阳性临界值等于平均值x+3sd，大于或者等于该值为阳性，反之即为阴性。
78.3.9特异性试验
79.取ibdv、alv、mdv、ndv、iltv标准阳性血清以及ibv阳性血清和阴性血清，以建立的间接elisa方法进行检测，通过检测血清交叉反应情况确定所建立方法的特异性。
80.3.10敏感性试验
81.选取阳性对照血清稀释1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600倍，按照建立的间接elisa方法检测od
450 nm
值，对检测结果进行分析，判断该方法的敏感性。
82.3.11重复性试验
83.按照本研究建立的间接elisa方法，在同一时间包被的酶标板上选取ibv阳性血清做10个重复，进行批内重复性试验，再选取3份不同批次制备的nsp4蛋白按照建立的间接elisa方法进行包被后对ibv阳性血清进行批间重复性试验，同样做10个重复，对检测结果进行统计学分析，根据变异系数公式：c.v％＝sd/x
×
100％计算其变异系数，判断该方法的重复性。
84.3.12临床应用
85.按照本研究建立的间接elisa方法对人工感染ibv 7dpi、14dpi、21dpi后的鸡血清样品以及7个不同养殖场采集的血清样品共400份进行检测。
86.3.13与试剂盒检测结果对比
87.随机选取92份血清样品，分别用本研究建立的间接elisa方法和idexx ibv抗体检测试剂盒进行检测，比对计算两种方法的符合率，通过计算kappa值比较建立的间接elisa方法与试剂盒检测结果的一致性(表2)。kappa值范围在-1到1之间，kappa值大于0.6即可表示有较高的一致性。
88.表2kappa值计算方法
[0089][0090]
注：kappa值＝p
0-pe/1-pe；p0＝a+d/n；pe＝[(n1*n3)/n+(n2*n4)/n]/n。
[0091]
4结果
[0092]
4.1最佳包被浓度和一抗检测浓度
[0093]
经对检测结果的分析和计算，在包被浓度为2μg/ml、一抗稀释度为1:100时，p/n值最大(表3)，为最佳包被浓度和一抗检测浓度。
[0094]
表3最佳包被浓度和一抗检测浓度的优化
[0095][0096][0097]
4.2酶标二抗最佳检测浓度
[0098]
经对检测结果的分析和计算，在酶标二抗稀释度为1:4000时，p/n值最大(表4)，为最佳酶标二抗检测浓度。
[0099]
表4酶标二抗最佳检测浓度的优化
[0100][0101]
4.3一抗最佳孵育时间
[0102]
经对检测结果的分析和计算，在一抗孵育时间为30min时，p/n值最大(表5)，为最佳一抗孵育时间。
[0103]
表5一抗最佳孵育时间的优化
[0104][0105]
4.4酶标二抗最佳孵育时间
[0106]
经对检测结果的分析和计算，在酶标二抗孵育时间为45min时，p/n值最大(表6)，为最佳酶标二抗孵育时间。
[0107]
表6酶标二抗最佳孵育时间的优化
[0108][0109]
4.5最佳封闭时间
[0110]
经对检测结果的分析和计算，在封闭时间为2h时，p/n值最大(表7)，为最佳封闭时间。
[0111]
表7最佳封闭时间的优化
[0112][0113]
4.6最佳显色时间
[0114]
经对检测结果的分析和计算，在显色时间为10min时，p/n值最大(表8)，为最佳显色时间。
[0115]
表8最佳显色时间的优化
[0116][0117]
4.7阴阳临界值
[0118]
经测定计算，阴阳性临界值为0.134(表9)，待测样品od
450 nm
值大于或者等于该值为阳性，反之即为阴性。
[0119]
表9阴阳临界值的确定
[0120][0121]
4.8特异性试验
[0122]
以ibdv、alv、mdv、ndv、iltv标准阳性血清以及ibv阳性血清和阴性血清作为一抗，使用建立的间接elisa方法进行检测，结果显示，仅ibv阳性血清有阳性反应，其余均为阴性(表10)，说明该方法特异性良好。
[0123]
表10特异性试验结果
[0124][0125]
4.9敏感性试验
[0126]
选取阳性对照血清稀释1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600倍，使用建立的间接elisa方法进行检测，结果显示，当阳性对照血清稀释度为1:3200时仍能检测为阳性(表11)，说明该方法敏感性良好。
[0127]
表11敏感性试验结果
[0128][0129]
4.10重复性试验
[0130]
按照本研究建立的间接elisa方法，在同一时间包被的酶标板上选取ibv阳性血清做10个重复，进行批内重复性试验，根据测定的od
450 nm
值计算变异系数，其批内重复性试验变异系数为4.6％(表12)，再选取3份不同批次制备的nsp4蛋白按照建立的间接elisa方法进行包被后对ibv阳性血清进行批间重复性试验，同样做10个重复，通过计算其批间重复性试验变异系数分别为6.2％、3.5％、4.6％(表13)。重复性试验结果显示该方法的变异系数均不超过7％，重复性良好。
[0131]
表12批内重复性试验结果
[0132][0133]
表13批间重复性试验结果
[0134][0135]
4.11临床应用
[0136]
按照本研究建立的间接elisa方法对人工感染ibv 7dpi、14dpi、21dpi后的鸡血清样品以及7个不同养殖场采集的血清样品共400份进行检测，共检出375份阳性，25份阴性，阳性率为93.75％。阴性多为人工感染ibv 14dpi及21dpi(表14)。
[0137]
表14临床应用结果
[0138][0139]
4.12与试剂盒检测结果对比
[0140]
随机选取92份血清样品，分别用本研究建立的间接elisa方法和idexx ibv抗体检测试剂盒(购自爱德士公司)进行检测，92份样品中与试剂盒检测结果相符合的有88份，符合率为95.6％，通过两种方法的检测结果(表15)计算kappa值＝0.815，表示所建立的方法与试剂盒有很高的一致性。
[0141]
表15间接elisa方法与试剂盒检测样品结果
[0142][0143]
5结论分析
[0144]
elisa作为ibv检测中最常用的血清学检测方法具有特异性强，敏感性好，操作简单，成本低廉等优势，在临床应用中不仅用来监测鸡群的免疫状态和鸡群感染情况，还可用于检测母源抗体对免疫的影响。本研究使用重组ibv nsp4蛋白为包被抗原，对构建的间接
elisa方法进行特异性、敏感性及重复性试验，结果显示该方法特异性高，仅与ibv发生反应，与ibdv、alv、mdv、ndv、iltv等病毒均不发生反应；将阳性血清稀释3200倍时仍能检测出，表明了该方法有较强的敏感性；对其进行重复性试验，其结果显示批内重复性变异系数为4.6％，批间重复性变异系数均不超过7％，重复性良好，显示了nsp4作为非结构蛋白的稳定性，应用该方法对人工感染ibv 7dpi、14dpi、21dpi后的鸡血清样品以及7个不同养殖场采集的血清样品共400份进行检测，阳性率为93.75％，显示该方法对人工感染ibv以及临床血清样品都能进行检测，阴性多为人工感染ibv 14dpi、21dpi后的鸡血清样品，符合人工感染ibv后的抗体水平规律，可应用于大规模的抗体水平检测等，抽样使用与idexx ibv抗体检测试剂盒对比，其符合率为95.6％，通过计算kappa值可表明两种方法的一致性很好，说明该方法值得推广应用。
[0145]
当前研究中有不少根据ibv结构蛋白建立了间接elisa方法，但随着ibv的高度变异及其结构蛋白可能发生缺失或重组，其检测值也可能随之产生变化，寻求一种更为稳定的间接elisa方法能更有效地对ibv进行鉴别检测。本研究建立了ibv nsp4抗体间接elisa检测方法，经试验证实该方法特异性高，敏感性强，重复性好，变异系数在3-7％之间，具有很好的稳定性，对临床血清样品以及人工感染ibv的血清样品均能检出，可应用于临床进行大规模的样品检测，有助于ibv的流行病学调查、抗体水平检测及免疫效果监测等。idexx ibv抗体检测试剂盒是ibv抗体水平检测的金标准，该方法与试剂盒有较高的符合率和一致性，证实本发明建立的间接elisa方法及检测试剂盒有很好的应用前景。
[0146]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。