一种利用差异血浆药物化学筛选水荭花中活性化合物的方法

本发明属于医药领域，特别涉及一种利用差异血浆药物化学筛选水荭花中活性化合物的方法。

背景技术：

1、中药化学成分复杂，进入体内经生物转化后生成活性更强的代谢产物或至活性降低，如何建立符合中药多成分复杂体系特点的中药药效物质基础的研究方法，是中药现代化研究需要迫切解决的关键问题。近年来，人们广泛应用生物模型、药物作用靶标进行药物筛选的研究工作，比如整体动物模型、受体模型和分子生物色谱、细胞模型和细胞膜色谱、基因芯片技术等等。如何建立快速有效筛选的方法，仍然是近年来研究的热点。

2、口服用药是中医药治疗的主要给药方式，药物口服后经胃肠道吸收、体内生物转化进入血液循环系统、分布到各组织器官与靶细胞结合，是其发挥疗效的重要影响因素。因此，以体内直接作用物质为切入点，研究血清中的移行成分(原型成分、代谢产物或体内应激成分)，有助于发现原型吸收入血成分，明确药物在体内的活性代谢产物；采用中药血清药物化学(体内)分析，能够避免遗漏在体内以活性代谢产物形式发挥作用的成分，以及本身具有活性却因体内生物转化反而活性降低的物质，将成为快速、准确地研究中药药效物质基础的有效途径，相对于“植物化学－药理活性”和“活性导向分离”等传统的体外研究方法具有明显的优势，是中药药效物质基础研究的有效手段。

3、然而，基于正常模型的中药血清药化在应用中存在一定的不合理之处：机体在正常生理与病理状态下，对药物的吸收、分布、代谢不同。药物在病理状态下，病理状态下机体肠道菌群、各种酶及蛋白的功能可能发生改变，从而使药物的动力学行为和作用机理发生变化，以正常动物为载体的血药物化学研究，未必能真正揭示中药治疗某一疾病的药效物质基础。生理病理状态下的差异血清药物化学研究利用了血清药物化学在中药药效物质中研究的优势同时结合了疾病状态对机体影响，能够有效筛选出发挥作用的直接体内作用物质，因此开展病理状态下的血清药物化学研究更有助于寻找到中药活性化合物。

4、水荭花，民间习称“荭草花”，是蓼科植物荭草polygonum orientale l.的干燥花序，其全株“荭草”收载于2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》，是贵州民间常用药物，贵州民间主要将其用于治疗胸痹心痛，心胃气痛等症，对治疗冠心病、心绞痛疗效确切。经研究发现“水荭花”是“荭草”抗心肌缺血的主要药用有效部位，具有比其全株“荭草”更明显的抗心肌缺血作用，但其抗心肌缺血的活性成分尚不明确，进一步阐明水荭花药效物质基础，将对水荭花药用资源的深层次开发应用具有积极意义。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的是提供一种利用差异血浆药物化学筛选水荭花中活性化合物的方法。

2、为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、一种利用差异血浆药物化学筛选水荭花中活性化合物的方法，包括以下步骤：

4、(1)基于uplc-q-tof技术分析水荭花提取物中的化学成分；

5、(2)建立基于uplc-q-tof技术的水荭花血浆药物化学分析方法；

6、(3)基于正常大鼠和miri大鼠的水荭花血浆药物化学筛选潜在活性化合物；

7、(4)潜在活性化合物的心肌保护作用验证。

8、作为优选，所述步骤(1)中基于uplc-q-tof技术分析水荭花提取物中的化学成分，包括以下步骤：色谱条件；质谱条件；化学成分分析。

9、作为优选，所述步骤(2)中建立基于uplc-q-tof技术的水荭花血浆药物化学分析方法包括以下步骤：血浆样品处理方法优化；采血时间筛选；给药剂量筛选。

10、作为优选，所述血浆样品处理方法优化包括以下步骤：取同一批次血浆样品，分为4等份，各加入1％甲酸水溶液，涡混；第1份加入甲醇，涡混，超声，离心，取上清液n2吹干，得甲醇沉淀样品；第2份加入乙腈，涡混，超声，离心，取上清液n2吹干，得乙腈沉淀样品；第3份加入乙酸乙酯，涡混，超声，离心，萃取，合并上清液，n2吹干，得乙酸乙酯萃取样品；第4份加入正丁醇萃取，萃取之后合并上清液，n2吹干，得正丁醇萃取样品；4份处理好的样品，加50％甲醇复溶，涡混，超声，离心，取上清液进uplc-q-tof检测。

11、作为优选，所述采血时间筛选包括以下步骤：取健康sd大鼠，雄性，给药前12h进食，自由饮水；给药前称重，取空白血后按85g/kg生药量灌胃给予水荭花提取物的1％cmc-na混悬液，每日两次，连续给药三天，末次给药后15min、30min、45min、1h、1.5h分别经尾静脉取血，全血经离心，分离血浆，得各时间点血浆样品；取所述各时间点血浆样品，加入乙酸乙酯，涡混，超声，离心，共萃取3次，合并上清液，n2吹干，加50％甲醇复溶，进uplc-q-tof分析。

12、作为优选，所述给药剂量筛选包括以下步骤：取健康sd大鼠，雄性，给药前12h进食，自由饮水；给药前称重，取空白血，随机分为3组，三个组分别按生药量40g/kg、60g/kg、85g/kg分别灌胃给予水荭花提取物的1％cmc-na混悬液，每日两次，连续给药三天，末次给药后45min经股动脉取血，全血经分离血浆，得到各组的血浆样品；所述各组的血浆样品，加入乙酸乙酯，涡混，超声，离心，合并上清液，共萃取3次，n2吹干，加50％甲醇复溶，进uplc-q-tof ms分析。

13、作为优选，所述步骤(3)基于正常大鼠和miri大鼠的水荭花血浆药物化学筛选潜在活性化合物包括以下步骤：

14、s1：复制大鼠心肌缺血再灌注损伤模型；

15、s2：分别灌胃给予正常大鼠和心肌缺血再灌注损伤大鼠水荭花提取物；

16、s3：末次给药后收集各组大鼠的血浆；

17、s4：大鼠血浆经前处理后分别进uplc-q-tof ms分析，获得血浆总离子流色谱图；

18、s5：对比分析生理、病理状态下血浆移行成分“量”的差异，筛选在正常生理状态和病理状态下大鼠血浆中的共有移行成分；利用化学计量学手段结合t检验，对比分析水荭花提取物在生理状态下和病理状态下大鼠的血浆移行成分“量”的差异，筛选出潜在活性化合物。

19、作为优选，所述步骤s5中通过对比分析生理病理的差异血浆移行成分，确定水荭花提取物的差异原型入血成分、潜在活性代谢产物的原药成分，包括山奈酚、槲皮素、槲皮苷、山奈素-3-o-β-d-葡萄糖苷和n-p-香豆酰酪胺。

20、作为优选，所述步骤s5中潜在活性化合物的筛选包括以下步骤：在分别获得正常组大鼠和miri组大鼠的含药血浆总离子流色谱图后，利用masslynx、unifi软件结合对照品比对，对血浆移行成分进行结构表征；选取生理、病理血浆指纹谱的共有峰，利用主成分分析、正交偏最小二乘法，并结合独立样本t检验，以vip值>1，且t检验p<0.05的标准，筛选出生理状态和病理状态下的水荭花差异血浆移行成分，明确水荭花在生理和病理状态下具有差异的原型入血成分、潜在活性代谢产物的原药成分。

21、作为优选，所述步骤(4)潜在活性化合物的心肌保护作用验证包括以下步骤：健康大鼠，随机分为正常对照组、模型对照组、阳性药组和各潜在活性化合物给药组；模型对照组、阳性药组和各潜在活性化合物给药组制备miri模型，再灌注24h后开始给药；各潜在活性化合物给药组分别给予5种潜在活性化合物单体的1％cmc-na混悬液；阳性药组给予复方丹参片1％cmc-na混悬液；正常组和模型对照组给予同等体积的1％cmc-na水溶液；分别于末次给药后经股动脉采血，全血经离心，分离血浆，分装保存，备用；将制备得到的血浆样品，按试剂盒说明测定血浆中sod活力，ldh，ck-mb和ctn-i泄漏量，用以评价潜在活性化合物的活性。

22、本发明具有以下有益效果：

23、本发明通过分析水荭花提取物在正常大鼠和心肌缺血再灌注损伤状态下大鼠的血浆移行成分，找出水荭花在生理和病理状态下“量”上的差异原型入血成分、潜在活性代谢产物的原药成分，它们有可能是发挥药效的潜在活性成分。在此基础上，复制miri大鼠模型，以各潜在活性化合物单体为研究对象，对筛选出来的潜在活性成分的药效学进行验证。本发明的研究结论证明了基于生理病理差异的血浆药物化学研究方法有望成为一种快速筛选中药中有效成分的研究方法。