含有丙氨酰谷氨酰胺的复方氨基酸药物组合物中杂质的检测方法与流程

本发明属于分析化学领域。具体地，本发明涉及一种含有丙氨酰谷氨酰胺的复方氨基酸药物组合物中杂质的检测方法。

背景技术：

1、丙氨酰谷氨酰胺是肠外营养产品中非常重要的一种双肽氨基酸，进入人体后可快速分解为丙氨酸和谷氨酰胺，且无毒副作用，其在肠外营养产品中的应用日益受到关注。但丙氨酰谷氨酰胺注射液是一种高浓度溶液，不可直接输注，其在输注前必须与可配伍的氨基酸或含有氨基酸的输液相混合，然后与载体溶液一起输注。配伍溶液关键质量控制指标包括丙氨酰谷氨酰胺降解杂质和复方氨基酸降解杂质的考察。对于成分复杂的配伍溶液来说，丙氨酰谷氨酰胺的主要降解杂质为l-焦谷氨酸、环-(l-丙氨酰-l-谷氨酰胺)、l-焦谷氨酰-l-丙氨酸和l-丙氨酰-l-谷氨酸，使用常规的高效液相色谱法检测时上述四种物质会受氨基酸溶液(18aa)复杂组分的干扰。而且配伍溶液中复方氨基酸注射液的降解杂质蛋氨酸亚砜对男性肝细胞具有一定的毒性损伤作用，也需重点控制。

2、simone等人使用lc-esi-ms/ms对肠外氨基酸注射液中的丙氨酰谷氨酰胺杂质进行检测，但是lc-esi-ms/ms设备昂贵，一般的实验室不具备该条件。simone等人还使用二维反向色谱×hilic分离模式，it-ms与cad做检测器，分析肠外氨基酸注射液中的丙氨酰谷氨酰胺杂质，该法同样设备昂贵，操作复杂，一般实验室不具备该条件。

3、中国专利申请cn111812259a公开一种复方氨基酸注射液中丙氨酰谷氨酰胺杂质的检测方法，其以亲水改性的烷基硅烷化学键合硅胶柱，以磷酸氢二铵为流动相，该方法中供试品溶液的制备需使用阳离子交换树脂吸附去除复方氨基酸注射液中的氨基酸组分，样品前处理操作复杂。

4、中国专利申请cn106248853a公开的测定复方氨基酸注射液的降解杂质蛋氨酸亚砜的含量的方法以及邵天舒等人提供的《邻苯二甲醛柱前衍生化-hplc测定复方氨基酸注射液中蛋氨酸亚砜的含量》的检测方法均需进行复杂的柱前衍生化，衍生化试剂邻苯二甲醛极易氧化，从而影响测定的重复性与准确性。

5、综上，1)当前没有同时分离测定配伍溶液中复方氨基酸杂质和丙氨酰谷氨酰胺杂质的相关报道；2)采用质谱类仪器对配伍溶液中的丙氨酰谷氨酰胺杂质进行检测，设备价格昂贵，一般的实验室不具备该条件；3)现有高效液相色谱法检测配伍溶液中丙氨酰谷氨酰胺杂质，由于复杂氨基酸组分(18aa)的干扰，需采用阳离子交换树脂吸附去除复方氨基酸注射液中的氨基酸组分，样品前处理操作复杂；4)测定配伍溶液中复方氨基酸降解杂质需进行复杂的柱前衍生化或者用到离子对试剂。

6、因此，需要建立一种科学有效、易于操作且能同时分离测定配伍溶液中复方氨基酸杂质和丙氨酰谷氨酰胺杂质的方法，既可降低检测成本、减轻劳动强度又节能环保。

技术实现思路

1、针对以上问题，本发明的目的是提供一种含有丙氨酰谷氨酰胺的复方氨基酸药物组合物中杂质的检测方法。该方法可同时检测丙氨酰谷氨酰胺降解杂质和复方氨基酸的其他降解杂质，且供试品溶液无需复杂前处理过程，方法简便、快速、准确。

2、本发明的上述目的是通过提供以下技术方案实现的：

3、本发明提供一种含有丙氨酰谷氨酰胺的复方氨基酸药物组合物中杂质的检测方法，其采用高效液相色谱法，所述高效液相色谱法的条件包括：

4、采用以氨基丙基三乙氧基硅烷键合硅胶或氨基丙基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以体积比为(25～45)：(75～55)的磷酸二氢钾缓冲液-乙腈为流动相；

5、其中，所述磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.001～0.03mol/l；

6、所述磷酸二氢钾缓冲液用磷酸调节ph至2.5～5.5。

7、优选地，所述药物组合物包含丙氨酰谷氨酰胺、甲硫氨酸和一种或多种选自盐酸半胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、门冬氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、盐酸精氨酸、盐酸赖氨酸、缬氨酸、苏氨酸、盐酸组氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、甘氨酸、醋酸赖氨酸、精氨酸、组氨酸、门冬酰胺、盐酸鸟氨酸、乙酰酪氨酸或乙酰半胱氨酸的氨基酸。

8、进一步优选地，所述药物组合物包含丙氨酰谷氨酰胺、甲硫氨酸和一种或多种选自盐酸精氨酸、盐酸组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、盐酸赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、盐酸半胱氨酸、门冬氨酸或谷氨酸的氨基酸。

9、优选地，所述药物组合物的杂质选自蛋氨酸亚砜、环-(l-丙氨酰-l-谷氨酰胺)、l-焦谷氨酰-l-丙氨酸、l-焦谷氨酸或l-丙氨酰-l-谷氨酸中的一种或多种；

10、更优选地，所述药物组合物的杂质包括蛋氨酸亚砜、环-(l-丙氨酰-l-谷氨酰胺)、l-焦谷氨酰-l-丙氨酸、l-焦谷氨酸和l-丙氨酰-l-谷氨酸。

11、优选地，所述以氨基丙基三乙氧基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为agilentzorbax original nh2色谱柱，所述以氨基丙基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为watersspherisorb amino nh2色谱柱。

12、在本发明中，所述以氨基丙基三乙氧基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱的规格为4.6×250mm，填料粒径为5.0μm，ph范围为2～7，孔径为载碳量为4％，例如agilentzorbax original nh2色谱柱。所述氨基丙基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱的规格为4.6×250mm，填料粒径为5.0μm，ph范围为2～8，孔径为载碳量为2％，例如watersspherisorb amino nh2色谱柱。

13、优选地，所述磷酸二氢钾缓冲液-乙腈的体积比为(30～40)：(70～60)。

14、优选地，所述磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.005～0.02mol/l。

15、优选地，所述磷酸二氢钾缓冲液用磷酸调节ph至3.0～5.0。

16、优选地，所述流动相的洗脱方式为等度洗脱。

17、优选地，所述色谱柱的规格为(3.0～4.6)×(50～300)mm，优选为4.6×250mm。

18、优选地，所述色谱柱的填料粒径为2.7～5.0μm，优选为5.0μm。

19、优选地，所述流动相的流速为0.5～1.5ml/min，优选为0.7ml/min。

20、优选地，所述色谱柱的柱温为20～40℃，优选为30℃。

21、优选地，所述高效液相色谱法的条件还包括：进样量为5～100μl，优选为20μl。

22、优选地，所述高效液相色谱法的条件还包括：检测波长为200～220nm，优选为215nm。

23、优选地，所述高效液相色谱法包括以下步骤：

24、(1)将环-(l-丙氨酰-l-谷氨酰胺)、l-焦谷氨酰-l-丙氨酸、l-焦谷氨酸和l-丙氨酰-l-谷氨酸和蛋氨酸亚砜定量溶于稀释剂，获得对照品溶液；

25、(2)将所述药物组合物定量溶于稀释剂，获得供试品溶液；

26、(3)分别取所述供试品溶液和对照品溶液，按照所述高效液相色谱法的条件进行检测。

27、优选地，所述稀释剂为流动相。

28、优选地，所述供试品溶液中丙氨酰谷氨酰胺的浓度为2～5mg/ml。

29、优选地，所述供试品溶液中除丙氨酰谷氨酰胺外的氨基酸的浓度为2.5～4.5mg/ml。

30、优选地，所述对照品溶液中环-(l-丙氨酰-l-谷氨酰胺)、l-焦谷氨酰-l-丙氨酸、l-焦谷氨酸和l-丙氨酰-l-谷氨酸和蛋氨酸亚砜的浓度分别为0.0002～0.4mg/ml、0.0015～0.052mg/ml、0.0015～0.02mg/ml、0.003～0.08mg/ml和0.002～0.02mg/ml。

31、本发明至少具有如下有益效果：

32、(1)本发明提供了含有丙氨酰谷氨酰胺的复方氨基酸药物组合物中杂质的检测方法，其可以同时检测丙氨酰谷氨酰胺降解杂质和复方氨基酸的其他降解杂质，该方法分离度好，专属性强。

33、(2)本发明提供的含有丙氨酰谷氨酰胺的复方氨基酸药物组合物中杂质的检测方法，使用常规高效液相色谱法进行检测，试剂均为易获得的常规试剂，且供试品溶液无需复杂前处理过程，方法简便、快速且准确，既可降低检测成本、减轻劳动强度又节能环保。