一种HLA抗体的即时检测卡及试剂盒的制作方法

一种hla抗体的即时检测卡及试剂盒
技术领域
1.本实用新型涉及免疫检测试剂盒，特别是一种hla抗体的即时检测卡及试剂盒。


背景技术：

2.hla抗体是引起排斥反应的主要危险因素之一(humoral theory of transplantation.terasaki pi.am j transplant.2003jun；3(6):665-73.doi:10.1034/j.1600-6143.2003.00135.x.；humoral theory of transplantation:mechanism,prevention,and treatment.cai j,terasaki pi.hum immunol.2005apr；66(4):334-42.doi:10.1016/j.humimm.2005.01.021.；human leukocyteantigen antibodies and chronic rejection:from association to causation.terasaki pi,cai j.transplantation.2008aug 15；86(3):377-83.doi:10.1097/tp.0b013e31817c4cb8.)。和移植排斥反应相关的hla抗原主要包括hla-i类和ii类抗原(肾移植人类白细胞抗原分型和抗体检测专家共识.中国医药生物技术协会移植技术分会上海市肾脏移植质控中心专家委员会.中华医学杂志2022,102(10):704-716doi:10.3760/cma.j.cn112137-20210830-01973)。
3.在移植前，如果因为既往输血、妊娠、移植史等因素，而导致病人体内有预存的hla抗体，将增加排斥反应的风险，并影响移植物的长期存活；在移植后，如果因为供受者之间存在错配的hla抗原，而导致病人产生针对移植物hla抗原的抗体，将增加术后因hla抗体引起的排斥反应的风险。因此，快速有效的hla抗体检测方法，不仅有助于在移植前预测病人排斥移植物的风险，而且有助于在移植后早期发现潜在的排斥反应风险。不管是移植前还是移植后，及时快速发现病人体内的hla抗体，将有利于临床上及时采取降低或清除抗体的针对性治疗措施，减少或避免hla抗体介导的反应的发生(hla抗体检测中重点问题的专家共识.中国输血协会hla专委会中国医药生物技术协会移植技术分会2022,43(3):129-134
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doi:10.3760/cma.j.issn421203-20211101-00266)。
4.目前临床上对hla抗体的检测，通常是采用纯化的hla抗原，借助elisa或流式荧光颗粒检测技术，来检测相应的hla抗体。目前应用最为广泛的是流式点阵仪检测法，如luminex技术。然而，目前常用的hla抗体检测方法存在如下三个主要缺点：第一，检测需要专业人员采用专门的仪器来完成，而且检测时间较长，通常在1.5-2小时或以上；这样的检测时长，不能很好地满足移植医生在急诊移植手术时，在最短的时间内，通过对hla抗体检测，快速判定患者是否存在hla抗体介导的排斥反应的风险，从而及时采取相应的预防性治疗措施，以提高移植成功率；第二，目前市场检测产品主要检测的是针对hla抗原的igg抗体类型，对于hla抗体的igm类型，需要采用相应的针对igm的检测二抗，花费与检测igg抗体类型同样的时间，另行独立检测，无法在一次检测中同时完成；第三，当前市场上的hla抗体检测产品，试图用统一的抗原组合产品，适用于全球各种群的应用人群，试剂中抗原的选取及组合上没有目标人群的针对性；导致其所选取的hla抗原对目标种群中常见的hla抗原的覆盖率非常低，因而对目标人群中特有的hla的抗体漏检十分严重。例如，当前市场产品中含
有的hla抗原种类，对中国人群常见的hla抗原的综合覆盖率仅为47％。(肾移植人类白细胞抗原分型和抗体检测专家共识.中国医药生物技术协会移植技术分会上海市肾脏移植质控中心专家委员会.中华医学杂志2022,102(10):704-716doi:10.3760/cma.j.cn112137-20210830-01973)。


技术实现要素：

5.针对目前hla抗体检测技术领域存在的问题，本实用新型提供了一种hla抗体的即时检测卡及试剂盒。
6.为了实现本实用新型的目的，本实用新型采用以下技术方案：
7.一种hla抗体的即时检测卡，包括hla抗体检测颗粒，所述hla抗体检测颗粒为表面包被有hla抗原的有色纳米颗粒，所述的hla抗原为单一i类/ii类hla抗原或i类/ii类hla抗原的组合。
8.优选地，所述有色纳米颗粒包括乳胶颗粒，胶体金，胶体碳，胶体硒，或者表面或内部标记了荧光素的纳米粒子。
9.优选地，所述i类hla抗原包括i类hla-a、-b、-c，所述ii类hla抗原包括ii类hla-dr、-dq、-dp。
10.优选地，所述hla抗体的即时检测卡在延伸方向上依次设置有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜垫和吸水垫，所述hla抗体检测颗粒设置于结合垫上，所述硝酸纤维膜垫在延伸方向上依次固定有抗人igm抗体和抗人igg抗体。
11.更优选地，所述硝酸纤维膜垫上还固定有抗鼠igg抗体，所述抗鼠igg抗体在延伸方向上与所述抗人igg抗体相邻。
12.优选地，所述hla抗体的即时检测卡还包括pvc背衬，所述pvc背衬用于黏附固定样本垫、结合垫、硝酸纤维膜垫和吸水垫。
13.一种hla抗体的即时检测试剂盒，包括上述hla抗体的即时检测卡。
14.优选地，所述hla抗体的即时检测试剂盒还包括一次性无菌采血针、无菌微量吸管、酒精棉片、血样稀释液及存装滴管。
15.本实用新型的有益效果如下：
16.1.采用了有色纳米颗粒标记hla抗原，通过免疫层析法原理，检测相应的hla抗体，实现了可以在10分钟内快速有效检测hla抗体，提供了一种简单易行、快速有效、病人可以自测的产品，更好地满足了急诊移植病人需要在最短时间内确认病人体内是否存在hla抗体的检测要求。
17.2.采用了检测hla特异性抗体的igg和igm两种抗体类型同时检测的设计思路，在hla抗体检测卡试剂条的不同检测区域，分别固定了抗人igm和抗人igg的捕获二抗，在一次检测中可以同时检出样本中igg或igm两种hla抗体；比较于目前检测技术中针对两种不同类型的hla抗体需要分别进行检测的方法，大大减少了工作量和检测时间。
18.3.采用了种群特异性的hla抗原选取原则，选取试剂盒目标应用人群中最常见的hla抗原及其组合，大大提高了对目标人群hla抗原的覆盖率，减少了对种群特异性hla抗体检测的漏检率。
19.4.根据选用的hla抗原的特点，i类或ii类hla混合抗原组成的检测卡，可用于一次
性快速筛查被检样本的i类或ii类的hla抗体；而含有单一hla抗原检测卡，则可用于检测供者hla抗原的特异性的抗体，即供者特异性抗体。
20.5.做成既可普筛使用又可自主选择特定抗原或组合的试剂盒，促进了快速检测技术在hla抗体检测领域的推广应用，并可适用于不同的检测目的。
附图说明
21.图1.本实用新型一种hla抗体的即时检测卡的结构示意图。
22.图2.是本实用新型单一抗原-胶体金颗粒的结构示意图。
23.图3.是本实用新型混合抗原-胶体金颗粒的结构示意图。
24.图4.本实用新型一种hla抗体的即时检测卡的检测原理示意图。
25.图中：
26.1、样品垫；2、结合垫；21、胶体金纳米颗粒标记的hla抗原，211、胶体金纳米颗粒，212、hla-a*1101抗原，213、hla-a*0201抗原，214、hla-b*4001抗原，215、hla-c*0702抗原，216、hla-c*0102抗原，217、hla-b*4601抗原，22、胶体金纳米颗粒标记的鼠igg抗体；3-硝酸纤维膜垫，31-igm检测线，311、hla的igm抗体，312、抗人igm抗体，32-igg检测线，321、hla的igg抗体，322、抗人igg抗体，33-阳性质控线，331、鼠igg抗体，332、抗鼠igg抗体；4-吸水垫，5-pvc背衬。
具体实施方式
27.下面结合具体实施方式对本实用新型进行详细说明，以下具体实施例有助于本领域技术人员对进一步理解本实用新型，但不以任何形式限制本实用新型。应当指出的是，在不脱离本实用新型构思的前提下，都可以对装置做出若干的变形或改造。这些都属于本实用新型的保护范围。
28.在本实用新型的描述中，需要说明的是，术语“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。另外，如未有特殊说明，以下实施例中所采用的材料及连接方式均可通过常规技术手段实现，本技术中将不再一一赘述。
29.根据不同个体的实际检测需要，试剂盒中检测卡上有色纳米颗粒标记的抗原的选取，遵循如下原则：
30.1.对样本中i类或ii类hla抗体进行全面性的筛查时，应选择从人源细胞纯化而来的i类或ii类hla混合抗原及其组合，组合中抗原的种类和数量要尽可能覆盖目标人群中常见的i类或ii类抗原，否则容易导致未选取的hla抗原相应抗体的漏检；如表1所示。
[0031][0032][0033]
本实用新型试剂盒中可供选择的抗原种类，对中国人群hla抗原的覆盖率分别达到了hla-a 99.04％，hla-b 97.81％、hla-c 98.50％、hla-dr 98.21％、hla-dq 99.57％、hla-dp 96.49％；所有i类和ii类抗原的综合覆盖率大于90％，远高于目前市场上采用luminex流式点阵仪技术进行的，常规hla抗体检测法产品中所含hla对中国人群的43％的综合覆盖率。如表2所示。
[0034]
表2.本实用新型检测试剂盒和市场常规hla抗体检测产品所含hla抗原对中国人群hla抗原覆盖率比较
[0035][0036]
2.在对某一特定移植病人，需要检测病人样本中是否存在供者特异性的i类或ii类hla抗体，但并不需要明确抗体是特异性针对某一特定hla抗原时，可选择从供者细胞上纯化而来的i类或ii类hla抗原的混合物构成的抗体检测卡，分别检测供者特异性的i类和ii类hla抗原的igm或igg抗体。
[0037]
3.在对某一特定移植病人，需要检测病人样本中是否存在供者特异性的i类或ii类hla的抗体，并需要明确判断抗体是针对具体某一个或数个供者特异性hla抗原时，应选用重组表达的、供者特异性的单一hla抗原所构成的抗体检测卡；根据供受者之间hla的实际错配抗原类别和数量，选取相应的的检测卡及组合。
[0038]
本实用新型中，hla抗体检测颗粒为表面包被有hla抗原的有色纳米颗粒，有色纳米颗粒用胶体金，乳胶纳米颗粒、或表面或内部标记了荧光素的纳米粒子等标记hla抗原，检测hla抗体的即时检测法的检测原理基本类似，差别是有色纳米颗粒的检测结果肉眼可读，而表面或内部标记了荧光素的纳米粒子检测法的结果需要借助配套的荧光检测器。现以胶体金纳米颗粒标记hla抗原的检测技术为例对具体实施方案加以详细说明。
[0039]
实施例
[0040]
如图1所示，本实用新型一种hla抗体的胶体金检测卡从左至右分别包括如下功能区：样品垫1：血清、血浆、全血、以及样本稀释液的加样区；结合垫2：喷涂有胶体金纳米颗粒标记的hla抗原21(用于检测)以及胶体金纳米颗粒标记的鼠igg抗体22(用作阳性质控)；硝酸纤维膜垫3：即样本检测区，从左至右，分别固定了抗人igm抗体、抗人igg抗体，及抗鼠igg抗体；吸水垫4：用于产生自左向右的液相流动的吸引力；pvc背衬5：用于黏附固定样品垫1、结合垫2、硝酸纤维膜垫3及吸水垫4。
[0041]
本实用新型中，胶体金纳米颗粒表面包被了hla单一抗原、或数种hla抗原组成的混合抗原。单一抗原是经重组表达后纯化而来，其包被的胶体金纳米颗粒，用于检测该抗原特异性的hla抗体，如图2所示的单一抗原-胶体金颗粒，是在胶体金纳米颗粒211表面包被单一的hla-a*1101抗原212形成的；hla混合抗原是直接从人源细胞表面纯化而来的i类或ii类抗原的混合物，混和抗原包被的胶体金纳米颗粒，用于对i类或ii类hla抗体的筛查检测，如图3所示的混合抗原-胶体金颗粒，是在胶体金纳米颗粒211表面包被hla-a*1101抗原212、hla-a*0201抗原213、hla-b*4001抗原214、hla-c*0702抗原215、hla-c*0102抗原216和hla-b*4601抗原217形成的。试剂盒中可供选取的i类或ii类hla抗原及其组合，是根据试剂盒的目标应用人群中常见的hla类型进行选取，具有人群针对性，减少了对人群特异性hla抗体的漏检。
[0042]
结合图4所示，hla抗体的胶体金检测法的检测原理是：本检测方法以胶体金纳米颗粒211作为示踪标记物，标记用于检测抗体的hla抗原。当样本中存在hla的igm抗体311或hla的igg抗体321时，在流经载有胶体金纳米颗粒标记的hla抗原21的结合垫2时，样本中hla的igm抗体311或hla的igg抗体321，就会和胶体金纳米颗粒标记的hla抗原21结合，形成
胶体金纳米颗粒-hla抗原-hla抗体(igm或igg)三价复合物，该复合物在试纸条上随液相从样品垫1向硝酸纤维膜垫3(即样本检测区)流动时，当遇到样本检测区中分别固定了抗人igm抗体312的igm检测线31和抗人igg抗体322的igg检测线32时，复合物就会被固定在指定的igm和igg检测线上的抗人igm或抗人igg抗体俘获，引起胶体金纳米颗粒-hla抗原-hla抗体的复合物在检测线区域发生集聚。原本在离散状态时在肉眼下不显色的胶体金纳米颗粒211，因聚集成团，而显肉眼可见之色。
[0043]
本检测方法中所采用的阳性质控对照，是胶体金纳米颗粒标记的鼠igg抗体22，和胶体金纳米颗粒标记的hla抗原21一样，被吸附在结合垫2上。当胶体金纳米颗粒标记的鼠igg抗体22随着液相从左至右移动至位于检测区最右侧的阳性质控线33时，胶体金纳米颗粒211标记的鼠igg抗体331被固定在阳性质控线33上的抗鼠igg抗体332捕获，导致胶体金纳米颗粒211标记的鼠igg抗体331在阳性检测线区域发生集聚。原本在离散状态时在肉眼下不显色的胶体金纳米颗粒211，因聚集成团，而显肉眼可见之色。
[0044]
本实用新型为了推广快速有效的hla抗体检测法，还提供了一种hla抗体的即时检测试剂盒，其中包括一次性无菌采血针、无菌微量吸管、酒精棉片、血样稀释液及存装滴管、以及上述载有有色纳米颗粒标记的hla抗原的即时检测卡。根据具体的检测需求，不同的hla抗体的检测卡上，分别载有一个或多个一组的hla-i类或ii类抗原(见图2和3)。hla抗体检测者可根据所需检测的hla抗体的实际需要，选择载有不同hla抗原的检测卡或组合，为临床的具体检测提供了灵活多样的检测需求选项。hla抗体的即时检测卡，在密封的情况下，可以在0-30℃的条件下，保存和运输。
[0045]
本实用新型试剂盒使用方法：
[0046]
本使用方法以含有胶体金纳米颗粒标记的hla-a*1101抗原的检测卡来检测a*1101抗体为例，作详细的使用说明。
[0047]
(1)从4℃冷藏箱中取出抗体检测试剂盒，预热至室温。
[0048]
(2)检测所用样本包括血清、血浆、或全血。血清或血浆样本10μl，或全血样本20μl。采用全血时，需在指尖采样。
[0049]
(3)指尖采样方法：指尖采血前，用试剂盒提供的酒精棉片进行消毒，待消毒部位自然干燥。然后使用一次性无菌采血针在指腹侧穿刺皮肤进行采血。用无菌棉球将第一滴血擦除。之后，适当挤压破口外侧指腹，帮助第二滴血滴出。然后，用标有刻度的微量无菌吸管采血20μl。
[0050]
(4)在样本垫加样区滴加血清或血浆样本10μl，或全血样本20μl，待样本被充分吸收。
[0051]
(5)在样本垫加样区滴加样本稀释液(ph为7.0-7.4的pbs)100-150μl，待液体充分吸入。
[0052]
(6)在1-15分钟内，加入的样本和稀释液，会因吸水垫引起的吸引力，自左往右移动。
[0053]
(7)加样后，样本中的hla-a*1101的igm或igg抗体将随着液相自左往右流动，抗体到达结合垫后，会和位于结合垫上的胶体金纳米颗粒标记的hla-a*1101抗原相结合，形成胶体金颗粒-hla-a*1101抗原-hla-a*1101抗体的复合物。
[0054]
(8)胶体金颗粒-hla-a*1101抗原-hla-a*1101抗体的复合物将继续随着液相自左
往右流动，在到达预先固定了抗人igm或igg的抗体的检测线区域时，由于抗人igm或抗人igg的抗体和hla-a*1101的igm或igg抗体的特异性结合，胶体金颗-hla-a*1101抗原-hla-a*1101抗体的复合物被抗人igm或igg的抗体捕获并固定，不能继续右移。被捕获固定的胶体金的复合物，由原来离散状态下不显色的胶体金纳米颗粒，因聚集而颗粒变大后显色。
[0055]
(9)和胶体金纳米颗粒标记的hla-a*1101抗原一起，被同时加载在结合垫上的阳性质控颗粒-胶体金颗粒标记的鼠igg抗体，同样随着加入的液相样本和稀释液自左往右流动。当移动到检测区最右侧的阳性质控线位置时，固定在阳性质控线上的抗鼠igg抗体，捕获并固定胶体金颗粒标记的鼠igg抗体，导致原先在离散状态下不显色的胶体金纳米颗粒，因聚集后显色。这一条带的显色作为胶体金免疫层析法的阳性对照，用于确认该检测系统的可靠性。
[0056]
显然，本实用新型的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本实用新型所作的举例，而并非是对本实用新型的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本实用新型的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本实用新型的保护范围之列。