一种检测磺胺类药物的免疫胶体金试剂板的制作方法

1.本实用新型涉及生物检测领域，特别涉及一种检测磺胺类药物的免疫胶体金试剂板。


背景技术：

2.磺胺类药物（sulfonamides，sas）是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，具有广谱抗菌活性，而且使用方便、性质稳定、价格便宜，因此该类药物被广泛用于动物疾病的预防和治疗。每年，sas的使用量都非常可观，例如2018年养殖使用的兽用抗菌药中，sas制剂数量最多，多达38种。欧盟、美国、加拿大规定动物源食品中sas总量不得超过100 μg/kg，日本规定不得超过20 μg/kg。我国农业部235号公告明确规定：所有动物源性食品中，磺胺类药物总量的最高残留限量为100μg/kg。sas主要在畜禽、水产品、牛奶、蜂蜜和禽蛋等动物性食品中存在部分残留，若长期食用含有该类药物的食物，会导致耐药性菌株的产生、引起过敏、中毒甚至癌变等症状，对人体健康有很大危害。因此，建立一种操作简便、快速、准确的sas残留检测方法，对于动物源性食品的安全监测具有重要意义。
3.目前，已报道的sas检测方法主要有仪器法和免疫分析法。仪器法主要有色谱/质谱法、分光光度法、毛细管电泳法等，特异性好、灵敏度高，但由于存在对设备、环境、操作技能等要求，不能满足现场快速检测的要求。免疫分析法常用的有酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法。酶联免疫吸附法所需设备较少，适合批量检测，但由于酶活性易受反应条件影响，且检测时间较长，具有一定的局限性。
4.胶体金免疫层析法操作方便，适合现场检测；成本较低，灵敏度较高，检测时间较短，一般在5-10 min，检测结果肉眼可见。现有的磺胺类免疫胶体金试剂板产品的检出限高于100 ppb，或存在试纸条t线、c线的线条宽度和颜色深浅不一致、假阳性/假阴性高的问题。部分厂家通过先将样品液与金标在金标微孔中充分反应，再滴加试剂板进行检测，解决试剂板显色不均一的问题，但增加了操作步骤和出错率，降低了检测效率。因此，开发一种检测线符合要求，同时显色好、灵敏度和准确度较高的检测磺胺类药物的胶体金试剂板具有重要意义。


技术实现要素：

5.本实用新型的目的在于提供一种显色好、灵敏度和准确度较高的检测磺胺类药物的胶体金试剂板。
6.本实用新型提供了一种检测磺胺类药物的免疫胶体金试剂板，其特征在于，包括塑料外壳和胶体金试纸条，所述塑料外壳由上壳体和下壳体组成，所述胶体金试纸条由底板和底板上依次连接的样品垫、金标垫、缓冲垫、反应膜和吸水垫组成；
7.所述金标垫上包被有胶体金标记的抗磺胺类药物单克隆抗体；
8.所述缓冲垫包被有缓冲溶液；
9.所述反应膜上沿层析方向依次设有检测线t线和质控线c线；其中，t线上包被有磺
胺类药物-载体蛋白偶联物，c线上包被羊抗鼠igg二抗。
10.本实用新型中，所述缓冲溶液由pbs、triton-100和bsa组成。作为优选，所述缓冲溶液由0.1 mol/lpbs、1%triton-100和1% bsa组成。
11.本实用新型中，所述缓冲垫经过上述缓冲溶液处理，能够调节样品溶液与金标抗体反应溶液的ph值。
12.本实用新型中，所述缓冲垫的长度为6 mm。
13.本实用新型中，所述t线和c线的间隔为4~6 mm。作为优选，所述t线和c线的间隔为5 mm。
14.本实用新型中，所述样品垫、金标垫、缓冲垫、反应膜、吸水垫的相邻各部分间均有1~2 mm的重叠。其目的一方面是保证层析作用从样品垫到吸水垫部位顺利进行，另一方面是为了使样品溶液与样品垫有充分反应时间。
15.本实用新型中，所述底板为pvc板；所述样品垫、缓冲垫、金标垫均由玻璃纤维膜制成；所述反应膜为硝酸纤维素膜；所述吸水垫为滤纸。
16.本实用新型中，所述样品垫经样品垫处理液浸泡后烘干制得，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液ph的作用，保证样品溶液中的有效成分与金标垫上的金标抗体顺利发生反应。
17.本实用新型中，所述磺胺类药物-载体蛋白的偶联物中，载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白。作为优选，载体蛋白为牛血清白蛋白。
18.本实用新型中，所述塑料外壳由上壳体和下壳体组成，起固定胶体金试纸条及标示功能。所述上壳体上设有加样孔和观察窗，通过加样孔将待测样本滴在胶体金试纸条的样品垫上，观察窗用于观察t线和c线的显色情况，近加样孔端设有防滑螺纹，近观察窗端设有溯源二维码；所述下壳体设有固定试纸条的定位槽。
19.使用本实用新型提供的试剂板进行检测时，将一定量的待检测溶液滴至加样孔2，静置等待3-5 min后观察所述观察窗9中t线7和c线8的颜色深浅（如图2所示），按照图3所示的判读方法，判定检测样本中磺胺类药物残留情况。
20.本实用新型试剂板具有如下有益效果：
21.（1）灵敏度和准确性高：本实用新型提供的试纸条，在金标垫和反应膜之间增加了一块6 mm长的缓冲垫，提高了反应体系的抗压能力和承受能力，提高结果准确性。
22.（2）显色好：胶体金试纸条的缓冲垫经缓冲溶液处理，能够调节样品溶液与金标抗体反应溶液的ph值，使检测线和控制线显色更均匀。
23.（3）操作简单快速：本实用新型提供的试剂板不需要大型仪器设备，操作简便，加样后3-5 min即可以用肉眼根据t线和c线颜色深浅读取结果，不需要专业操作人员，价格便宜，携带方便，特别适用于基层监管人员现场快速检测。
24.（4）安全环保：本实用新型提供的试剂板配备的试剂没有毒性或毒性极小，不会对人体造成危害。
25.（5）本实用新型试剂板设有溯源二维码，可在使用胶体金读数仪度数时记录检测样本信息，防止重复读数，适用于现场快速检测和大批量样品筛查。
附图说明
26.为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
27.图1为本实用新型一种检测磺胺类药物的免疫胶体金试剂板的剖面结构示意图与对应的胶体金试纸条的俯视图；其中，1：上壳体；2：加样孔；3：样品垫；4：金标垫；5：缓冲垫；6：反应膜；7：检测线；8：质控线；9：观察窗；10：吸水垫；11：底板；12：下壳体。
28.图2为本实用新型一种检测磺胺类药物的免疫胶体金试剂板的俯视图；其中，13：防滑螺纹；s：加样孔；9：观察窗；14：溯源二维码。
29.图3为本实用新型一种检测磺胺类药物的免疫胶体金试剂板的操作示意图。
30.图4为本实用新型一种检测磺胺类药物的免疫胶体金试剂板的结果判断示意图，其中t为检测线，c为质控线。
具体实施方式
31.下面结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型的保护范围。
32.如图1-2所示：
33.一种检测磺胺类药物的免疫胶体金试剂板，包括上壳体1、下壳体12和胶体金试纸条，上壳体上设有加样孔2和观察窗9，在近加样孔端设有防滑螺纹13，近观察窗端设有溯源二维码14，下壳体设有固定试纸条的定位槽。胶体金试纸条包括底板11和底板上依次连接的样品垫3、金标垫4、缓冲垫5、反应膜6和吸水垫9；所述金标垫4上包被有胶体金标记的抗磺胺类药物单克隆抗体；所述缓冲垫5由玻璃纤维膜经缓冲溶液浸泡后晾干制得；所述反应膜6上沿层析方向依次设有检测线t线7和质控线c线8；其中，t线上包被有磺胺类药物-载体蛋白偶联物，c线上包被羊抗鼠igg二抗。
[0034] 实施例1一种检测磺胺类药物的免疫胶体金试剂板的制备：
[0035]
1、样品垫的制备
[0036]
（1）样品垫处理液的配制：称取38.137 g na2b4o7•
10h2o、10 g pvp、1 g bsa、10 ml triton x-100，加1 l h2o溶解、调节ph9.3。
[0037]
（2）样品垫3由玻璃纤维膜经缓冲溶液浸泡后烘干制成，起吸收样品溶液与缓冲样品溶液ph值的作用；将样品垫用样品垫处理液浸泡15 min以上，放置在37℃的干燥箱中，烘至16 h以上。
[0038]
2、金标垫的制备
[0039]
（1）金标垫处理液的配制：称取5 g pva、7.1 g na2hpo4、5 g bsa、1 ml triton x-100，加1 l h2o溶解，调节ph为7.4。
[0040]
（2）金标垫预处理：金标垫由玻璃纤维膜制成，是样品溶液中的有效成分与金标抗体发生反应的场所；用金标垫处理液浸泡30 min，放置在37℃的干燥箱中烘干。
[0041]
（3）将胶体金标记的抗磺胺类药物单克隆抗体按照标记量20
ꢀµ
l/cm，喷量4
ꢀµ
l/cm，以喷涂的方式固着于预处理后的金标垫上，干燥4 h，密封保存。
[0042]
3、缓冲垫的制备
[0043]
缓冲垫5的长度为6 mm，由玻璃纤维膜经缓冲溶液浸泡后晾干制得。具体制备方法为：用0.1 mol/lpbs+1%triton-100+1% bsa混合溶液浸泡玻璃纤维膜后晾干制得。
[0044]
4、反应膜的制备
[0045]
反应膜6为硝酸纤维素膜，反应膜6上沿层析方向依次设有检测线t线7和质控线c线8；其中，t线上包被有磺胺类药物-载体蛋白偶联物，包被浓度为0.1 mg/ml，喷量为1
ꢀµ
l/cm；c线上包被羊抗鼠igg二抗，包被浓度为1 mg/ml，喷量为1
ꢀµ
l/cm，置于37 ℃烘箱干燥8 h。
[0046]
5、吸水垫10为滤纸，其作用是将层析上来的多余的溶液吸收。
[0047]
6、底板11为pvc板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。
[0048]
7、胶体金试纸条的组装：如图1所示，将样品垫3、金标垫4、缓冲垫5、反应膜6、吸水垫10依次黏贴于pvc底板上组装成胶体金试纸条，相邻各部分间均有1~2 mm的重叠，用切割机将卡片分切成3.0 mm宽的胶体金试剂条。
[0049]
8、试剂板的组装：试剂板由上壳体1和下壳体12组成，如图2所示，上壳体1上设置有加样孔3和观察窗9，近加样孔端设有防滑螺纹13，近观察窗端设有溯源二维码14，下壳体12设置有固定试纸条的定位槽；将组装好的胶体金试纸条放置在下壳体12的定位槽中固定，胶体金试纸条的样品垫3正对上壳体1加样孔3位置，将组装好的试剂板和干燥剂放入外包装袋密封保存。
[0050]
本实用新型一种检测磺胺类药物的免疫胶体金试剂板的操作流程见图3，将试剂板水平放置于桌面，将一定量的待检测溶液垂直滴至加样孔3，静置等待几分钟后观察所述观察窗9中t线7和c线8的颜色深浅。
[0051]
本实用新型一种检测磺胺类药物的免疫胶体金试剂板检测结果的判读方法见图4，t线显色比c线强或者一样强，为阴性；t线没有显色或显色比c线弱，为阳性；c线不显色，不论t有无显色均为无效。
[0052]
实施例2检出限测定实验
[0053]
实验对比有缓冲垫的试剂板和无缓冲垫的试剂板的检出限。在阴性溶液中加入磺胺类药物标准品溶液至终浓度为5、10、50、100
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g/kg，分别滴定有缓冲垫的试剂板和无缓冲垫的试剂板，用胶体金读数仪测定检测数据和检测结果，实验结果见表1，阴性结果：t/c值≥1.0，阳性结果：t/c值＜1.0。
[0054]
表1 试剂板检出限实验结果
[0055][0056]
结果显示，本实用新型提供的一种检测磺胺类药物的免疫胶体金试剂板在金标垫和反应膜之间增加了缓冲垫，明显提高了灵敏度，试剂板检出限更低、显色更好。
[0057]
以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本实用新型的保护范围。