一种基于量子点免疫层析的牛免疫球蛋白G定量检测试纸的制作方法

本发明涉及牛免疫球蛋白g定量检测，具体为一种基于量子点免疫层析的牛免疫球蛋白g定量检测试纸及检测方法。

背景技术：

1、免疫球蛋白（immunoglobulin，ig）是一类具有抗体活性的、化学结构与抗体相似的球蛋白，其能够与抗原结合中和毒性，与补体结合抵抗入侵的细菌、病毒等病原，增强机体的防御能力。牛的免疫球蛋白广泛存在于血清和乳汁中，尤其在初乳（指牛生产后72小时内乳腺的初始分泌物，属于生理异常乳）中含量最高，主要类型为igg、iga和igm，其中igg占80%。检测牛血清或牛乳中牛igg含量，有助于牛场评价犊牛被动免疫效果，指导初乳饲喂，从而有效提高犊牛成活率、降低发病率；也可为生产奶粉、乳制品的乳品厂提供有力的产品质量监管手段；另外在生物制药（疫苗、保健品）、生物化妆品（美容面膜）、日用化学品（新型功能牙膏）等领域，检测牛igg含量对产品质量安全性评价也是至关重要的。由此可见，建立一种快速、准确、便捷的牛igg含量的检测方法必定会在畜牧兽医、乳制品、生物制药、化妆品、化学品和标准品生产等行业得到推广和应。

2、目前，牛igg含量的检测方法主要有紫外分光光度法、免疫分析法和亲和色谱法，其中免疫分析法以琼脂扩散法、免疫比浊法和酶联免疫法为主，这些方法各有利弊。紫外分光光度法虽然操作简单、成本较低，但其仅适用于标准物质、igg纯品以及动物血清样品中牛igg含量的分析；而免疫分析法和亲和色谱法虽然分析准确、重复性好，但都需要复杂仪器设备支撑，实施成本较高，操作繁琐，耗时较长，无法应用到基层。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种基于量子点免疫层析的牛免疫球蛋白g定量检测试纸及检测方法，达到实现了集快速、简单、准确和成本低廉为一体的牛血清、牛乳或牛乳制品等样本中牛igg的定量检测，具有良好的应用前景的目的。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于量子点免疫层析的牛免疫球蛋白g定量检测试纸，包括免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条分别为qd-lf-夹心法试纸条和 qd-lf-竞争法试纸条；

3、所述免疫层析试纸条包括有粘性底衬、分析膜、结合垫、样品垫、吸水纸，所述分析膜贴于粘性底衬的中间，吸水纸贴于分析膜的一侧且与分析膜形成第一结合区，结合垫贴于分析膜的另一侧且与分析膜形成第二结合区，样品垫贴于结合垫的另一侧之上且与结合垫形成第三结合区，所述分析膜表面设置有检测线、质控线。

4、优选的，所述qd-lf-夹心法试纸条和qd-lf-竞争法试纸条的分析膜表面上的质控线均为2mg/ml 羊抗兔多克隆抗体，所述qd-lf-夹心法试纸条的分析膜表面上的检测线为3mg/ml兔抗牛igg多克隆抗体，所述qd-lf-竞争法试纸条的分析膜表面上的检测线为2mg/ml牛igg。

5、优选的，所述qd-lf-夹心法试纸条的结合垫以qd标记的兔抗牛igg多克隆抗体为示踪物，所述qd-lf-竞争法试纸条的结合垫以qd标记的牛igg为示踪物。

6、一种基于量子点免疫层析的牛免疫球蛋白g定量检测方法，所述方法包括以下步骤：

7、步骤一、牛igg 的提取；

8、步骤二、牛igg免疫及兔抗牛igg多克隆抗体效价测定；

9、步骤三、用0.01 mol/l 的 pb（磷酸盐缓冲液）分别将羊抗兔抗体、兔抗牛igg多克隆抗体和牛igg稀释至喷膜使用浓度后进行层析膜喷膜，置于37℃烘干；

10、步骤四、取 0.2 g/ml的量子点20μl加入到1.5ml 离心管中，加入标记缓冲液 500μl，置于恒温振荡器上，加入活化试剂 15μl，1400r/min 振荡1h，加入兔抗牛igg多克隆抗体或牛igg 0.05mg，置于25℃、1400r/min振荡2 h，再加入终浓度为1%的牛血清白蛋白，1400r/min震荡1h，加入0.01 mol/l pb（ph 值为 7.0）3.88 ml，混匀，使用毛细管快速浇至玻璃纤维上，置于 37 ℃烘干3h，干燥保存，备用；

11、步骤五、取层析封闭液（含1%牛血清白蛋白的0.01 mol/l pb，ph 值为 7.0）2 ml，浇至裁切好的玻璃纤维上，置于37℃烘干2h，干燥保存，备用；

12、步骤六、2种试纸条敏感性、线性、精密性评价以及现场评价；

13、步骤七：数据的统计分析。

14、优选的，步骤一具体如下：

15、取牛血清60ml加入到烧杯中，边搅拌边滴加醋酸钠溶液，调节ph值至4.5；再滴加正辛酸溶液5ml，于常温下搅拌均匀，置于4℃放置1h，转移至50 ml离心管中，12000r/min离心30min，取上清液用滤纸过滤后，在上清液中加入1/10体积的0.1mol/l的pbs（磷酸盐缓冲液），调节ph值至7.0，边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液至总体积的50%，4℃放置2 h，12000r/min离心30min，弃掉上清液；

16、用0.01 mol/l的pbs重悬离心后的沉淀物，于4℃进行透析，每间隔2h更换透析液1次，直至完全去除氨离子；

17、用微量紫外分光光度计检测牛igg的浓度，冻存，备用。

18、优选的，所述步骤二具体如下：

19、用制备好的牛igg抗原分别免疫2只大耳白兔，免疫方式为单次皮下注射200mg，免疫周期为2周1次，进行4次免疫，在第4次免疫2周后，分别取2只大耳白兔的耳缘静脉血进行酶联免疫吸附试验以检测2份血清中兔抗牛igg多克隆抗体效价，当血清稀释倍数大于等10万且450nm的吸光度（odg）大于0.200时停止免疫，进行颈动脉采血，此血清稀释倍数即为兔抗牛igg多克隆抗体效价，将采集的2份兔血液经4℃、5000r/min离心15min后收集上层血清（血清编号 1#和2#）；参照牛igg提取方法进行血清中兔抗牛igg多克隆抗体的提取，测定兔抗牛igg多克隆抗体浓度及效价，冻存，备用。

20、优选的，所述步骤六具体如下：

21、敏感性评价：用0.03 mol/l pb 将牛igg进行梯度稀释，获得0，0.1，0.3，0.5，0.7，1，3，5，7，10，30，50，70，100μg/ml系列浓度标准品，分别用 2 种试纸条进行检测，以 0.03mol/l pb 作为空白对照，重复测试 3 次。夹心法试纸条以空白对照检测带信号（t）/质控带信号（c）值的平均值+3 倍的标准 差为 cutoff 值，当样本的t/c 值≥cutoff 值时，该样本的 t/c 值所对应的牛 igg 的含量即为夹心法试纸条的检出限；竞争法试纸条以空白对照的 t/c 值的平均值-3倍的标准差为 cutoff 值，当样本的 t/c 值≤cutoff值时，该样本的 t/c 值所对应的牛 igg 的浓度即为竞争法试纸条的检出限；

22、线性评价：夹心法试纸条以lg（t/c 值-cutoff 值）为横坐标，竞争法试纸条以 lg（t/c 值）为横坐标，两类试纸条均以lg（标准品浓度）为纵坐标绘制定量标准曲线；

23、精密性评价：待测标准品的每个浓度重复测试3次，计算3次检测值的变异系数（cv），变异系数越小说明精密性越好；

24、现场评价：选取检测性能更优的试纸条进行现场检测，样本为 50 份牛初乳（样本编号1~50）和2份巴氏乳（样本编号51和52），同时用折光仪进行测定，随机抽取 5 份牛初乳与 2 份巴氏乳进行液相色谱测定，对比3种方法检测的牛igg含量的相关性，以评价试纸条检测方法的准确性。

25、优选的，所述步骤七具体如下：采样excel软件进行验数据的统计学分析，分别绘制2种试纸检测牛igg标准品的定量标准曲线，绘制折光仪和最优试纸条检测52份乳样中牛igg含量的对比柱状图，绘制折光仪、最优试纸条和液相色谱检测7份乳样中牛igg 含量的对比柱状图，并用excel软件分析3种方法检测结果的相关性。

26、本发明提供了一种基于量子点免疫层析的牛免疫球蛋白g定量检测试纸及检测方法。具备以下有益效果：

27、（1）、本发明通过设置量子点免疫层析试纸，包括粘性底衬、分析膜、结合垫、样品垫、吸水纸，所述分析膜贴于粘性底衬的中间，吸水垫贴于分析膜的一侧且与分析膜形成第一结合区，结合垫贴于分析膜的另一侧且与分析膜形成第二结合区，样品垫贴于结合垫的另一侧之上且与结合垫形成第三结合区，所述分析膜表面设置有检测线、质控线。经过实验后，发现其qd-lf-竞争法试纸条能够对复杂牛乳及初乳样本中牛 igg 的含量进行精准定量，这是紫外分光分光法所不能实现的；试纸条操作非常简单，仅需样本稀释、上样、上机读值三步，15min即可完成检测，输出结果，且不需要昂贵的设备和专业的操作场所。

28、（2）、本发明通过所获得的量子点免疫层析试纸条 (竞争法) 真正实现了集快速、简单、准确和成本低廉为一体的牛血清、牛乳或牛乳制品等样本中牛igg的定量检测，具有良好的应用前景。