NALCN通道蛋白及其调节剂的制作方法

本公开尤其涉及na+泄漏通道非选择性蛋白(nalcn)与fam155a(也称为fam155；序列相似性家族155成员a)、unc79(未配位79)和unc80(未配位80)的复合物，筛选调节所述复合物的活性的分子的方法以及其经鉴定的调节剂。

背景技术：

1、在许多神经元中，nalcn(na+泄漏通道非选择性)通道体有助于调节静息膜电位、自发放电和起搏活动的基础na+泄漏电流。nalcn代表四结构域离子通道超家族的一个独特分支，并且是人的孤儿基因。与远距离相关的电压门控钠(nav)和钙(cav)通道不同，nalcn不受膜电位变化的门控。异源系统中的强大活性需要其他三种蛋白质的共表达：fam155a(也称为fam155；序列相似性家族155成员a)、unc79(未配位79)和unc80(未配位80)。例如，已发现nalcn和unc80的突变会导致一系列神经发育疾病，诸如运动、精神和视觉缺陷。fam155a、unc79和unc80与典型的nav或cav通道辅助亚基没有序列相似性，表明它们提供专门的支架或功能作用。

2、最近，确定了nalcn-fam155a成孔子复合物的基本结构，并揭示了fam155a在nalcn选择性滤波器上形成整合的圆顶状结构，而s6门在不存在unc79和unc80的情况下关闭。(m.kschonsak等人,nature 587:313-318(2020)；y.kang等人,nature comm.11:6199[doi.org/10.1038/s41467-020-20002-9](2000)；j.xie等人,nature comm.11:5831[doi.org/10.1038/s41467-020-19667-z](2000)。)unc79和unc80已被提议与nalcn物理相互作用，并且unc79已被建议结合unc80以促进nalcn的树枝状定位。然而，先前形成进一步包含unc79和unc80的nalcn和fam155a的复合物的尝试并未成功，并且仅产生nalcn-fam155a子复合物。(参见同上)

技术实现思路

1、本发明人现在已经成功地制备了nalcn、fam155a、unc79和unc80中所有四者的复合物，在一些实施例中，该复合物进一步含有钙调蛋白(cam)，如在下面的实例部分中更详细地描述的。并且本发明人通过冷冻电子显微镜以3.3-3.1埃的分辨率确定了该复合物的整体结构。例如，获得适合于功能测定法(诸如离子通道测定法)和结合亲和力测定法的这些蛋白质的复合物的能力除其他事项外允许筛选分子以鉴定复合物的调节剂和与复合物结合的分子。

2、因此，本技术包括例如一种鉴定人nalcn(na+泄漏通道非选择性)、fam155(序列相似性家族155成员a)、unc79(未配位79)和unc80(未配位80)的复合物(人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物)的调节剂的方法，该方法包括：(a)在体外提供人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物；(b)使该复合物与该复合物的潜在调节剂接触；(c)在存在该潜在调节剂的情况下进行该复合物的离子通道测定法；以及(d)如果在存在该潜在调节剂的情况下该测定法中该复合物的活性高于或低于在不存在该潜在调节剂的情况下该测定法中该复合物的活性，则将该潜在调节剂鉴定为该复合物的调节剂。在一些情况下，离子通道测定法为膜片钳或自动膜片钳测定法、离子流测定法或者离子或电压敏感染料测定法。在一些情况下，在存在潜在调节剂的情况下测定法中复合物的活性低于在不存在潜在调节剂的情况下测定法中复合物的活性(即，潜在调节剂降低测定法中复合物的活性)。在一些情况下，在部分(c)中鉴定的潜在调节剂降低测定法中复合物的活性至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些方面，在存在潜在调节剂的情况下测定法中复合物的活性高于在不存在潜在调节剂的情况下测定法中复合物的活性(即，潜在调节剂增加测定法中复合物的活性)。在一些实施例中，该方法进一步包括确定在部分(d)中所鉴定的潜在调节剂与人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物、人nalcn-fam155复合物、unc79-unc80复合物的结合亲和力，或者与人nalcn、fam155、unc79或unc80中的一者或多者的结合亲和力。在一些情况下，潜在调节剂以10μm或更低、10μm至50nm、10μm至500nm、1μm或更低、1μm至50nm或者100nm或更低的ec50或ic50与人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物结合。在一些方面，该方法在存在nalcn-dii-diii接头肽或nalcn-di-dii接头肽或人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的经鉴定的调节剂的情况下进行。在一些方面，接头肽包含seq id no:16至24中任一者的氨基酸序列，或包含seq id no:16至18或23至24中任一者的氨基酸序列。在一些情况下，该方法进一步包括确定潜在调节剂是否调节人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的活性，其中该复合物包含突变型人nalcn。在一些情况下，突变型人nalcn包含在di-dii接头或dii-diii接头中的一者或两者中的取代、插入或缺失。在一些情况下，di-dii接头或dii-diii接头被来自人或哺乳动物nav或cav蛋白(诸如来自人nav1.4)的对应区域替换；包含缺失；或者包含gggs元件的插入。在一些情况下，突变型人nalcn包含seq id no:7、8、12至15、32至52或59至63中任一者的氨基酸序列。在一些方面，该方法进一步包括确定潜在调节剂是否调节人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的活性，其中该复合物包含突变型人unc79，该突变型人unc79例如包含seq id no:53、54、55、58或64至73中任一者的氨基酸序列。在一些方面，该方法进一步包括确定潜在调节剂是否调节人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的活性，其中该复合物包含突变型人unc80，该突变型人unc80例如包含seq id no:74至85中任一者的氨基酸序列。

3、本公开还包括例如一种鉴定与人nalcn(na+泄漏通道非选择性)、人fam155(序列相似性家族155成员a)、人unc79(未配位79)和人unc80(未配位80)的复合物：(人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物)结合的分子的方法，该方法包括：(a)在体外提供人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物；(b)使该复合物与一种或多种测试分子接触，并使结合的测试分子与未结合的测试分子分离；以及(c)如果在使结合的测试分子与未结合的测试分子分离后测试分子保持与该复合物结合，则将该测试分子鉴定为与该人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物结合。

4、本公开还包括例如一种鉴定与人nalcn(na+泄漏通道非选择性)、人fam155(序列相似性家族155成员a)、人unc79(未配位79)和人unc80(未配位80)的复合物：(人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物)结合的分子的方法，该方法包括：(a)在体外提供人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物；(b)使复合物与nalcn-dii-diii接头肽或nalcn-di-dii接头肽接触，并进一步与测试分子接触；以及(c)如果该测试分子与该nalcn-dii-diii接头肽和/或该nalcn-di-dii接头肽竞争与该复合物的结合，则将该测试分子鉴定为与该人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物结合。

5、本公开还包括例如一种在体外鉴定调节人nalcn(na+泄漏通道非选择性)、人fam155(序列相似性家族155成员a)、人unc79(未配位79)和人unc80(未配位80)的复合物：(人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物)的形成或稳定性的分子的方法，该方法包括：(a)在其中促进人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物形成的条件下在体外提供人nalcn、人fam155、人unc79和人unc80；(b)使该复合物与测试分子接触；以及(c)如果与在不存在该测试分子的情况下相比，在存在该测试分子的情况下复合物形成的程度增加或降低，则将该测试分子鉴定为调节该人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的形成或稳定性。

6、在这些方法的一些方面，潜在调节剂以10μm或更低、10μm至50nm、10μm至500nm、1μm或更低、1μm至50nm或者100nm或更低的ec50或ic50与人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物结合。在一些方面，通过elisa、alphalisa或fret测定法来确定结合亲和力。

7、在一些情况下，对于本文方法中的任一者，人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的所述人nalcn、人fam155、人unc79或人unc80中的至少一者被标记。在一些情况下，人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的所述人nalcn、人fam155、人unc79或人unc80中的至少一者附着至基质，诸如珠、芯片或板。在一些情况下，人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物溶解在脂质双层、洗涤剂或脂质纳米盘中。在一些情况下，该方法进一步包括确定分子是否与人nalcn-fam155复合物、人unc79-unc80复合物结合，或者与人nalcn、fam155、unc79或unc80中的一者或多者结合。

8、在一些方面，在本文方法中的任一者中，该方法进一步包括确定测试分子是否与人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物结合，其中该复合物包含突变型人nalcn。在一些此类情况下，突变型人nalcn包含在di-dii接头或dii-diii接头中的一者或两者中的取代、插入或缺失。在一些情况下，di-dii接头或dii-diii接头被来自人或哺乳动物nav或cav蛋白(诸如来自人nav1.4)的对应环替换；包含缺失；或者包含gggs元件(seq id no:86)。在一些情况下，突变型人nalcn包含seq id no:7、8、12至15、32至52或59至63中任一者的氨基酸序列。在一些情况下，在本文方法中的任一者中，人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物进一步包含人钙调蛋白。

9、在一些情况下，在本文方法中的任一者中，潜在调节剂或测试分子为肽、大环或抗体。在一些情况下，潜在调节剂或测试分子为小分子。

10、本公开还涵盖例如通过本文的方法鉴定的分子。在一些情况下，此类分子为肽、大环或抗体。在其他情况下，其为小分子。本公开还包括一种如本文所述的复合物的经鉴定的调节剂，诸如人nalcn的经鉴定的肽调节剂，例如包含seq id no:16至18或23至24中任一者的氨基酸序列。

11、本公开还包括例如如本文所述的分子或经鉴定的调节剂在治疗受试者的神经发育疾病、昼夜节律疾病或疼痛中的用途，以及例如一种治疗患有神经发育疾病、昼夜节律疾病或疼痛的受试者的方法，该方法包括施用有效量的如本文所述的分子或经鉴定的肽调节剂。

12、本公开进一步包括例如试剂盒，该试剂盒包含以下中的至少一者：人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的经鉴定的调节剂，用于进行离子通道测定法的一种或多种试剂，任选地附着至基质诸如珠、芯片或板的经标记的nalcn、unc79、unc80或fam155，以及使用说明。

13、本公开还包括例如一种人nalcn、unc79、unc80和fam155的经分离的复合物，任选地，其中该复合物包含在脂质双层或脂质纳米盘内，并且任选地其中该人nalcn、unc79、unc80和fam155中的至少一者包含标记或者附着至基质，诸如珠、板或芯片。在一些情况下，复合物进一步包含通过本文方法中的任一者鉴定的人nalcn的调节剂或分子。

14、另外的目的和优点将部分地在下面的描述中阐述，并且部分地将从描述中理解，或者可以通过实践获知。这些目的和优点将通过所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。应理解，前述通用性说明和以下详细说明两者均为仅仅是示例性的和解释性的，并且不是对权利要求的限制。并入本说明书并构成本说明书一部分的附图示出了一个(几个)实施例，并且与说明书一起用于解释本文所述的原理。