一种25-OH-VD检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及25-羟基维生素d检测，尤其涉及一种25-oh-vd检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、维生素d是维持骨骼健康的主要元素。儿童期维生素d的严重缺乏将导致骨骼畸形，即佝偻病。维生素d是一种类固醇激素，经皮肤光照后产生，维生素d的两种重要形式包括维生素d3(胆钙化醇)和维生素d2(麦角钙化醇)，在人体中，维生素结合蛋白与维生素d3和维生素d2相结合，并将它们转运到肝脏中，在那里这两种形式都被羟基化，生成维生素d，即25-羟基维生素d。25-羟基维生素d是一种代谢产物，可在血清中检出，由于它是人体中维生素d的主要储存形式，能够促进肠道对钙的吸收以及调节钙平衡。25-羟基维生素d浓度降低与骨密度下降有关。结合其它临床资料，通过对血清中25-羟基维生素d对含量进行检测有助于评估骨代谢情况。

2、血清中检测出来的95％以上的25-羟基维生素d为25-羟基维生素d3，维生素d缺乏是继发性甲状旁腺机能亢进症的常见病因。提高甲状旁腺激素含量，特别是提高缺乏维生素d的老年人的甲状旁腺激素含量会导致骨软化症，增加了骨转化，降低了骨质量，并有骨折的危险。25-羟基维生素d3含量低还与骨密度低有关。与其他临床数据结合，对25-羟基维生素d3的含量进行检测可作为判定骨代谢的辅助手段。

3、目前使用传统检测试剂盒对血清中的25-羟基维生素d进行检测时，存在两方面的不足，一是灵敏度和精密度不够，二是无法完全解离出血清中的25-羟基维生素d，导致测量结果不准确。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提高对血清中的25-羟基维生素d检测结果的准确性、有效性以及检测效率。

2、为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：

3、一种25-oh-vd检测试剂盒，包括：

4、测试纸，所述测试纸包括底板，所述底板上沿其水平方向依次设有首尾连接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设有检测线和质控线，所述检测线上包被有25-羟基维生素d抗原，所述质控线上包被有鸡igy抗原；

5、t探针冻干粉，所述t探针冻干粉为量子点荧光标记的鼠抗人25-羟基维生素d单克隆抗体偶联复合物冻干得到；

6、c探针冻干粉，所述c探针冻干粉为量子点荧光标记的羊抗鸡igy单克隆抗体偶联复合物冻干得到。

7、优选地，所述底板为pvc底板。

8、本发明中，量子点是一类以碲化镉、硒化镉、硫化镉等为主要成分的具有电化学发光和光致发光特性的新型纳米荧光材料，该量子点为现有的量子点，在此不做赘述。

9、其进一步地技术方案为，还包括样本处理液，所述样本处理液含有0.3mna2co3，0.5mnacl，1％麦芽糖，0.5％sds以及0.3％0.5mm edta-na2。

10、其进一步地技术方案为，所述t探针冻干粉的制备方法包括以下步骤：

11、将edc和nhs在10-20mm的mes溶液下活化15-20分钟，活化后加入含有50-100μl量子点和30-60μg鼠抗人25-羟基维生素d单克隆抗体的20mm bs缓冲液中，偶联得到t探针；将t探针使用探针稀释液配制到指定用量，冻干，得到t探针冻干粉。

12、其进一步地技术方案为，所述c探针冻干粉的制备方法包括以下步骤：

13、将edc和nhs在10-20mm的mes溶液下活化15-20分钟，活化后加入含有50-100μl量子点和10-20μg羊抗鸡igy单克隆抗体的20mmbs缓冲液中，偶联得到c探针；将c探针使用探针稀释液配制到指定用量，冻干，得到c探针冻干粉。

14、优选地，所述mes溶液的ph为6.5-7.0，所述bs缓冲液的ph为7.0。

15、其进一步地技术方案为，所述t探针冻干粉的用量为0.05652±0.01立方厘米；所述c探针冻干粉的用量为0.05652±0.01立方厘米。

16、上述t探针冻干粉和c探针冻干粉采用冻干技术制得之后为疏松饼状，因此其用量用体积表示，上述用量能使试剂的灵敏度维持在较高水平。

17、在一个具体实施方案中，t探针冻干粉和c探针冻干粉是通过以下方式制备得到：按照t探针，c探针调试的用量，使用探针稀释液配制到指定用量，再将加入探针的稀释液放入冻干杯中，使用冻干机冻干，干燥完使用自封袋先包装起来，再用铝箔袋包装，在铝箔袋放置一定量的干燥剂，热封机封口备用。

18、在一个具体实施方案中，吸水纸通过以下方式制得：把采购到的吸水纸，放置50-55℃烤箱干燥42-48小时，把处理过的吸水纸裁成指定的大小备用。使用自封袋先包装起来，再用铝箔袋包装，在铝箔袋放置一定量的干燥剂，热封机封口备用。

19、其进一步地技术方案为，所述检测线包被的25-羟基维生素d抗原的浓度为0.3-0.5mg/ml。

20、其进一步地技术方案为，所述质控线包被的鸡igy抗原的浓度为0.3-0.5mg/ml。

21、进一步地，所述抗原为采用包被液稀释后的抗原；所述抗原的浓度为0.3-0.5mg/ml。

22、进一步地，所述鸡igy抗原为采用包被液稀释后的鸡igy抗原；所述鸡igy抗原的浓度为0.3-0.4mg/ml。

23、优选地，上述包被液为现有的包被液。

24、本发明中，包被液的组成包括：10mm pbs和5％海藻糖。

25、本发明中，通过喷金划膜仪将检测线和质控线喷在硝酸纤维素膜的指定位置上，置于50-55℃烤箱干燥42-48小时。

26、在一个具体实施方案中，使用常规包被液(10mm pbs+5％海藻糖)稀释抗原至0.3-0.5mg/ml，包被液稀释鸡igy抗体至0.3-0.5mg/ml；使用喷金划膜仪，把抗原包被在检测线的位置，把鸡igy包被在质控线的位置。将包被完成后的硝酸纤维素膜放进50-55℃烤箱干燥42-48小时。干燥完使用自封袋先包装起来，再用铝箔袋包装，在铝箔袋放置一定量的干燥剂，热封机封口备用。

27、其进一步地技术方案为，所述样品垫采用以下方法制备得到：

28、配制预处理液，把样品垫放置在预处理液中充分浸泡，把浸泡后的样品垫拿出放置筛网中，在35-37℃烤箱干燥18-24小时，把处理过的样品垫裁剪备用；

29、所述预处理液包括10-20mm bs、5-8％海藻糖和1-1.5％bsa。

30、所述样品垫为玻璃纤维膜。

31、其进一步地技术方案为，所述试剂盒还包括盒体、检测卡，所述测试纸设于检测卡上，检测卡上对应样品垫的位置设有加样孔；所述检测卡设于盒体内。

32、本发明还提供所述的25-oh-vd检测试剂盒在检测人血清中25-羟基维生素d的应用。

33、需要说明的是，本发明的检测原理是采用量子点荧光标记技术和抗体竞争法的原理：分别将被测物抗原和鸡igy包被在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线区域，将量子点荧光标记的鼠抗人单克隆抗体偶联复合物和量子点荧光标记的羊抗鸡igy单克隆抗体偶联复合物分布在冻干杯中。在检测过程中，将样本处理液加入冻干杯中，再将样本加入此冻干杯中，后取混合物加入加样孔，如样本中含有被测物，被测物可与量子点荧光标记的鼠抗人抗体偶联复合物结合，结合物可通过毛细管作用移动到硝酸纤维素膜上的检测线区域，剩余的量子点荧光标记的鼠抗人抗体偶联复合物并可被该处含有的抗原所捕捉，形成量子点荧光检测线条带，量子点荧光标记的羊抗鸡igy单克隆抗体偶联复合物将继续移动到质控线区域和鸡igy结合，形成量子点荧光质控线条带。样本中的被测物浓度与检测线的量子点荧光强度成负相关，经过干式荧光免疫分析仪的测定计算，可以确定样本中被测物的浓度。

34、与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：

35、本发明提供的25-oh-vd检测试剂盒，采用冻干技术将探针制作成冻干粉进行储存，使用时将探针冻干粉和样本一起加入样本处理液中混合均匀，通过将混合物滴加到测试纸中，根据检测线和质控线发出的荧光强度可以检测出样本中的25-oh-vd含量。本发明的试剂盒检测灵敏度可达5ng/mg，普遍优于市场上同类层析产品。此外，通过配制25-oh-vd配套样本处理液，可以将维生素结合蛋白的精密的维生素d解离脱下，可以让测量变得更加容易，精确度更高。

36、本发明提供的25-oh-vd检测试剂盒，具有高灵敏度、高特异性、简单快捷、易于操作和不需要大型仪器设备等优点。