一种分析烟草及香精香料中20种氨基酸的方法与流程

本发明属于烟草中化学成分分析的，涉及一种分析烟草及中20种氨基酸的方法。

背景技术：

1、氨基酸是烟草和香精香料中的重要化学成分之一，也是衡量其品质的一个关键指标。在烟叶烘烤、调制、醇化及抽吸过程中，游离氨基酸与还原糖会发生酶或非酶催化的棕色化反应，生成多种杂环类的化合物。同时，氨基酸的热解也会产生很多化学成分，如苯丙氨酸会热解产生苯甲醇、苯乙醛等化合物，其它氨基酸热解会产生吡咯、吲哚、吡啶、苯酚、氰化氢等化合物。这些化合物有些是香味成分，有些是刺激性成分，有些是有害成分，对产品品质的影响截然不同。因此，分析烟草和烟用香精香料中的氨基酸，深入研究其对烟草产品品质的影响，可为卷烟配方、烟叶调制、醇化等提供重要的理论指导。

2、由于氨基酸在烟草中的重要作用，其分析研究也得到了烟草行业研究人员的重视，目前国内外的分析方法有氨基酸自动分析仪法、毛细管电泳法、气相色谱法和液相色谱法等。烟草行业目前主要采用氨基酸自动分析仪法和气相色谱法来检测氨基酸。但是氨基酸自动分析仪法对于烟草等复杂基质样品，其检测易受到共流出峰的干扰，灵敏度也不高，只能对含量较高的几种氨基酸进行准确定量，其它氨基酸定量结果的准确性皆不理想。而气相色谱检测氨基酸的方法前处理复杂，氨基酸衍生化效率差异较大，使用的有机试剂毒性大，也并非理想的氨基酸检测方法。

3、多维液相色谱能将不同分离原理的液相色谱优化组合，具有较高的选择性和灵敏度，是分析复杂基质样品的理想选择。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种分析烟草及香精香料中20种氨基酸的方法，用于解决现有技术中缺乏基于多中心切割二维液相色谱法能够同时测定20种氨基酸的方法的问题。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种分析烟草及香精香料中20种氨基酸的方法，包括以下步骤：

3、1)样品预处理：将烟草或香精香料样品加入溶剂和内标溶液后混合、超声萃取后离心、过滤，获得样品预处理液；

4、2)样品柱前衍生：将步骤1)获得的样品预处理液分别与衍生试剂盒中缓冲试剂和衍生试剂进行混合后加热进行衍生化，获得样品待测液；

5、3)样品分析：将步骤2)获得的样品待测液采用多中心切割二维液相色谱法进行测定，确定样品待测液中20种氨基酸中至少一种的含量。

6、较佳地，所述烟草选自烟叶、烟末或烟丝中的至少一种。

7、上述烟末或烟丝要粉碎获得粉末样品。

8、优选地，所述烟叶选自青烟叶、烤后烟叶中的至少一种。

9、所述青烟叶要冷冻干燥后研磨，获得粉末样品；

10、所述烤后烟叶要烘干后粉碎，获得粉末样品。

11、较佳地，所述香精为常规使用的香精。具体来说，所述香精为多种香料调配出来的，用于产品加香的混合物。

12、较佳地，所述香料为天然香原料。所述天然香原料为常规使用的天然原料，包括精油、浸膏、净油、香膏、酊剂等形态。

13、较佳地，所述氨基酸选自组氨酸(his，cas号为71-00-1)、谷氨酰胺(gln，cas号为56-85-9)、精氨酸(arg，cas号为74-79-3)、天门冬酰胺(asn，cas号为70-47-3)、丝氨酸(ser，cas号为56-45-1)、甘氨酸(gly，cas号为56-40-6)、天冬氨酸(asp，cas号为56-84-8)、谷氨酸(glu，cas号为56-86-0)、苏氨酸(thr，cas号为72-19-5)、丙氨酸(ala，cas号为56-41-7)、脯氨酸(pro，cas号为147-85-3)、蛋氨酸(met，cas号为63-68-3)、缬氨酸(val，cas号为72-18-4)、半胱氨酸(pro，cas号为52-90-4)、赖氨酸(lys，cas号为56-87-1)、酪氨酸(tyr，cas号为60-18-4)、异亮氨酸(ile，cas号为73-32-5)、亮氨酸(leu，cas号为61-90-5)、色氨酸(trp，cas号为73-22-3)、苯丙氨酸(phe，cas号为63-91-2)中的至少一种。

14、优选地，所述氨基酸为20种，包括有组氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、天门冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸。

15、较佳地，步骤1)中，所述溶剂选自盐酸水溶液、甲醇水溶液中的至少一种。

16、优选地，所述溶剂为盐酸水溶液。更优选地，所述盐酸水溶液为浓度为0.05-0.15mol/ml的盐酸水溶液。进一步优选地，所述盐酸水溶液为浓度为0.1mol/ml的盐酸水溶液。

17、优选地，所述甲醇水溶液为浓度为50％-80％的甲醇的水溶液。进一步优选地，所述甲醇水溶液为浓度为70％的甲醇水溶液。

18、较佳地，步骤1)中，所述烟草或香精香料样品加入质量g与溶剂加入体积ml之比为1：10-20。

19、较佳地，步骤1)中，所述内标溶液为含正缬氨酸(nval，cas号为6600-40-4)的盐酸水溶液。优选地，所述内标溶液中正缬氨酸的浓度为2-3nmol/μl。更优选地，所述内标溶液中正缬氨酸的浓度为2.5nmol/μl。

20、优选地，所述内标溶液中盐酸水溶液的浓度为0.05-0.15mol/ml。更优选地，所述内标溶液中盐酸水溶液的浓度为0.1mol/ml。

21、较佳地，步骤1)中，所述内标溶液与溶剂加入的体积μl之比为1：30-70。

22、较佳地，步骤1)中，所述混合至均匀。一般为震荡摇匀。

23、较佳地，步骤1)中，所述超声萃取的时间为20-40min。

24、较佳地，步骤1)中，所述离心的转速为2800-3200r/min。

25、较佳地，步骤1)中，所述过滤为取离心后上清液进行滤膜过滤。所述滤膜为0.22μm水相滤膜。

26、较佳地，步骤2)中，所述衍生试剂盒为美国waters公司生产的商业化的accq-tagultra试剂盒。所述缓冲试剂为accq-tag ultra试剂盒配备的硼酸盐缓冲溶液。所述衍生试剂为accq-tag ultra试剂盒配备的accq-tag ultra试剂，其主要成分为6-氨基喹啉-n-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯。

27、较佳地，步骤2)中，所述样品预处理液与缓冲试剂加入的体积之比为10:50-90。

28、较佳地，步骤2)中，所述样品预处理液与衍生试剂的体积之比为10:10-40。

29、较佳地，步骤2)中，所述衍生化是将样品预处理液先与缓冲试剂进行第一次混合，再加入衍生试剂进行第二次混合后加热进行衍生化。

30、优选地，所述第一次混合和第二次混合为涡旋混合。

31、优选地，所述第一次混合的混合时间为5-15s。

32、优选地，所述第二次混合的混合时间为2-10s。

33、优选地，所述第二次混合后要进行静置。所述静置在室温下进行，所述室温为20-30℃。

34、更优选地，所述静置的时间为50-70s。优选为60s。

35、较佳地，步骤2)中，所述加热的温度为50-60℃。所述加热在恒温箱中进行。

36、较佳地，步骤2)中，所述加热的时间为5-11min。

37、较佳地，步骤3)中，所述多中心切割二维液相色谱法包括以下步骤：

38、a)将20种氨基酸中至少一种的标准品，加入溶剂，再加入内标溶液，配成的标准工作溶液与衍生试剂盒中缓冲试剂和衍生试剂进行混合后加热进行衍生化，获得标准品待测液；

39、b)将样品待测液和步骤a)中获得的标准品待测液采用多中心切割二维液相色谱系统进行测定，根据不同的保留时间通过第一维液相色谱分离出20种氨基酸中至少一种，捕集到不同捕集柱上，再将捕集成分洗脱后由第二维液相色谱分离检测，比较保留时间进行定性，采用内标法进行定量，确定样品待测液中20种氨基酸中至少一种的含量。

40、优选地，步骤a)中，所述标准工作溶液是将20种氨基酸中至少一种的标准品加入溶剂，获得混合储备溶液，经逐级稀释后，加入内标溶液，再加入溶剂溶解定容后获得。

41、更优选地，所述混合储备溶液中每种氨基酸的浓度均为20-30nmol/μl，优选为25nmol/μl。

42、更优选地，所述标准工作溶液中内标的浓度为20-100pmol/μl，优选为50pmol/μl。

43、优选地，步骤a)中，所述溶剂选自盐酸水溶液、甲醇水溶液中的至少一种。

44、更优选地，所述溶剂为盐酸水溶液。进一步优选地，所述盐酸水溶液为浓度为0.05-0.15mol/ml的盐酸水溶液。更进一步优选地，所述盐酸水溶液为浓度为0.1mol/ml的盐酸水溶液。

45、更优选地，所述甲醇水溶液为浓度为50％-80％的甲醇的水溶液。进一步优选地，所述甲醇水溶液为浓度为70％的甲醇水溶液。

46、优选地，步骤a)中，所述内标溶液为含正缬氨酸(nval，cas号为6600-40-4)的盐酸水溶液。更优选地，所述内标溶液中正缬氨酸的浓度为2-3nmol/μl。进一步优选地，所述内标溶液中正缬氨酸的浓度为2.5nmol/μl。

47、更优选地，所述内标溶液中盐酸水溶液的浓度为0.05-0.15mol/ml。进一步优选地，所述内标溶液中盐酸水溶液的浓度为0.1mol/ml。

48、优选地，步骤a)中，所述衍生试剂盒为美国waters公司生产的商业化的accq-tagultra试剂盒。所述缓冲试剂为accq-tag ultra试剂盒配备的硼酸盐缓冲溶液。所述衍生试剂为accq-tag ultra试剂盒配备的accq-tag ultra试剂，其主要成分为6-氨基喹啉-n-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯。

49、优选地，步骤a)中，所述标准工作溶液与缓冲试剂加入的体积之比为10:50-90。

50、优选地，步骤a)中，所述标准工作溶液与衍生试剂的体积之比为10:10-40。

51、优选地，步骤a)中，所述衍生化是将标准工作溶液先与缓冲试剂进行第一次混合，再加入衍生试剂进行第二次混合后加热进行衍生化。

52、更优选地，所述第一次混合和第二次混合为涡旋混合。

53、更优选地，所述第一次混合的混合时间为5-15s。

54、更优选地，所述第二次混合的混合时间为2-10s。

55、更优选地，所述第二次混合后要进行静置。所述静置在室温下进行，所述室温为20-30℃。

56、进一步优选地，所述静置的时间为50-70s。优选为60s。

57、优选地，步骤a)中，所述加热的温度为50-60℃。所述加热在恒温箱中进行。

58、优选地，步骤a)中，所述加热的时间为5-11min。

59、优选地，步骤b)中，所述多中心切割二维液相色谱系统为常规使用的多中心切割二维液相色谱系统，其具体结构见图1。

60、优选地，步骤b)中，所述第一维色谱分离出20种氨基酸中至少一种采用多中心切割法。

61、所述多中心切割法为多维色谱中常用的馏分切割转移法，在本发明的二维液相色谱中，即将第一维液相色谱分离出的多个目标物的色谱峰所对应的洗脱液分批次转移至第二维液相色谱，其它洗脱液部分不进第二维液相色谱。

62、优选地，步骤b)中，所述第一维液相色谱的测定条件为：

63、检测器：选自二极管阵列检测器、荧光检测器或质谱检测器中的至少一种；第一分离柱：选自c18色谱柱或cn色谱柱中的一种；柱温：45-55℃；进样量：1-10μl；流速：0.1-0.5ml/min；检测波长：255-265nm；流动相a相：含0.05-0.1％甲酸的水；流动相b相：甲醇；分析时间：100min；梯度洗脱。

64、进一步优选地，所述第一维液相色谱的测定条件为：

65、检测器：二极管阵列检测器(dad)；第一分离柱：cn色谱柱(2.1mm×100mm，5μm)(具体参见产品官网http://www.agela.com.cn/product/detail/500)；柱温：50℃；进样量：2μl；流速：0.3ml/min；检测波长：260nm；流动相a相：含0.1％甲酸的水；流动相b相：甲醇；分析时间：100min；梯度洗脱。

66、进一步优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：

67、0-2min，a相：b相体积比为95：5-95：5；

68、2-12min，a相：b相体积比为95：5-5：95；

69、12-20min，a相：b相体积比为5：95-5：95；

70、20-20.01min，a相：b相体积比为5：95-50：50；

71、20.01-75min，a相：b相体积比为50：50-50：50；

72、75-75.01min，a相：b相体积比为50：50-95：5；

73、75.01-100min，a相：b相体积比为95：5-95：5。

74、优选地，步骤b)中，所述捕集柱的捕集条件为：

75、捕集柱：c18色谱柱，优选为xbridge c18色谱柱(4.6mm×30mm，5μm)；补偿泵流动相：选自去离子水、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、甲酸盐缓冲液、氨水溶液中的至少一种，优选为去离子水；补偿泵流动相的流速为1000-1500μl/min，优选为1200μl/min。所述补偿泵流动相用于降低进入捕集柱的流动相的有机相比例。

76、更优选地，所述第二维液相色谱的测定条件为：

77、检测器：选自二极管阵列检测器、荧光检测器或质谱检测器中的至少一种；第二分离柱：选自c18色谱柱、aq色谱柱、t3色谱柱或rp18色谱柱中的至少一种；柱温：50-60℃；流速：0.5-2ml/min；激发波长为264-268nm，发射波长为471-475nm；流动相a相：含0.05-1％甲酸的水；流动相b相：乙腈；分析时间：100min；梯度洗脱。

78、进一步优选地，所述第二维液相色谱的测定条件为：

79、检测器：荧光检测器(fld)；第二分离柱：aq色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)；柱温：55℃；流速：1.0ml/min；激发波长为266nm，发射波长为473nm；流动相a相：含0.1％甲酸的水；流动相b相：乙腈；分析时间：100min；梯度洗脱。

80、进一步优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：

81、0-15min，a相：b相体积比为98：2-98：2；

82、15-16min，a相：b相体积比为98：2-96：4；

83、16-20min，a相：b相体积比为96：4-96：4；

84、20-25min，a相：b相体积比为96：4-80：20；

85、25-25.01min，a相：b相体积比为80：20-10：90；

86、25.01-30min，a相：b相体积比为10：90-10：90；

87、30-30.01min，a相：b相体积比为10：90-100：0；

88、30.01-35min，a相：b相体积比为100：0-100：0；

89、35-45min，a相：b相体积比为100：0-80：20；

90、45-45.01min，a相：b相体积比为80：20-10：90；

91、45.01-50min，a相：b相体积比为10：90-10：90；

92、50-50.01min，a相：b相体积比为10：90-98：2；

93、50.01-55min，a相：b相体积比为98：2-98：2；

94、55-57min，a相：b相体积比为98：2-90：10；

95、57-65min，a相：b相体积比为90：10-90：10；

96、65-70min，a相：b相体积比为90：10-75：25；

97、70-70.01min，a相：b相体积比为75：25-10：90；

98、70.01-75min，a相：b相体积比为10：90-10：90；

99、75-75.01min，a相：b相体积比为10：90-98：2；

100、75.01-80min，a相：b相体积比为98：2-98：2；

101、80-90min，a相：b相体积比为98：2-40：60；

102、90-90.01min，a相：b相体积比为40：60-10：90；

103、90.01-95min，a相：b相体积比为10：90-10：90；

104、95-95.01min，a相：b相体积比为10：90-98：2；

105、95.01-100min，a相：b相体积比为98：2-98：2。

106、优选地，步骤b)中，所述内标法是指，将20种氨基酸中至少一种的标准品，加入溶剂和内标溶液后进行衍生化，配成的一系列不同浓度的标准品待测液采用多中心切割二维液相色谱系统分析，获得20种氨基酸中至少一种的标准品/内标的色谱峰面积比与相应浓度比的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到标准工作曲线的回归方程；再将样品待测液采用多中心切割二维液相色谱系统分析，获得20种氨基酸中至少一种与内标的色谱峰面积比，代入标准工作曲线的回归方程中，计算得到样品待测液中相应氨基酸的含量。

107、更优选地，所述标准工作曲线中，以20种氨基酸中至少一种与内标的色谱峰面积比为纵坐标(y轴)，其相应氨基酸与内标的浓度比为横坐标(x轴)。

108、如上所述，本发明提供的一种分析烟草及香精香料中20种氨基酸的方法，针对存在复杂基质的烟草及香精香料中氨基酸种类多，杂质干扰大等特点，可实现烟草及香精香料中20种氨基酸的同时定量分析。通过多维色谱的分离有效去除杂质干扰，减少对氨基酸分离的干扰，适用于多种氨基酸的同时检测，为烟草及香精香料中氨基酸的检测提供了一种更加准确灵敏的分析方法。