一种用于抗aPS/PT抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂及化学发光检测试剂盒的制作方法

本发明涉及磁微粒化学发光检测，具体涉及一种用于抗aps/pt抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂及化学发光检测试剂盒。

背景技术：

1、自身免疫性疾病种类繁多，几乎可以影响身体的任何部位，包括心脏、大脑、神经、肌肉、皮肤、眼睛、关节、肺、肾脏、腺体、消化道和血管。

2、抗磷脂抗体综合征(antiphospholipid syndrome，aps)是一种以反复发生的血栓形成、血小板减少、流产为主要临床特征，并伴有血清中抗磷脂抗体(antiphospholipidantibodies，apl)存在的临床综合征。系统性红斑狼疮(systemiclupus erythematosus，sle)是一种多发于育龄期女性的累及全身多脏器的自身免疫性炎症性结缔组织病，可引起继发性aps。sle患者体内b细胞过度活化，血浆中可检测到大量自身抗体，包括抗双链dna(double strand dna，dsdna)抗体、抗核抗体(anti-nuclearantibody，ana)、抗肾小球基底膜抗体、抗ssa抗体、抗ssb抗体、抗磷脂抗体等。

3、抗磷脂抗体是一组针对各种带负电荷磷脂、磷脂结合蛋白、磷脂-蛋白复合物的自身抗体的总称。现有研究认为，抗磷脂抗体通过干扰各种依赖磷脂的凝血因子和抗凝因子而影响机体的凝血功能。实验研究发现抗磷脂抗体在系统性红斑狼疮发病和疾病进展过程中起着重要作用，与狼疮性肾炎、凝血功能、血栓、疾病活动度密切相关。aps的临床实验诊断标准包括：抗β2糖蛋白1(anti-β2-glycoprotein 1，aβ2gpi)igg、igm、抗心磷脂(anticardiolipin，acl)igg、igm和狼疮抗凝物(lupus anticoagulant，la)。研究显示：除以上临床诊断标准抗体外，尚有数十种非诊断标准抗体(non-criteria apls)，包括抗磷脂酰丝氨酸抗体(anti-phosphatidylserine antibodies，aps)、抗凝血酶原抗体(antiprothrombin antibody，apt)、抗磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物抗体(anti-phosphatidylserine/prothrombin complex antibodies，aps/pt)，在自身免疫病的发生和发展中亦发挥重要的作用。凝血酶原通常与带负电荷的磷脂酰丝氨酸形成磷脂-磷脂结合蛋白复合物。aps/pt作为临床检测指标，与血栓及产科并发症等相关性较强，主要用于诊断标准抗体阴性时的补充检测项目，或与多个抗磷脂抗体同时检测，提高检测的准确性。

4、aps/pt已纳入国际aps评分（gapss）系统用于预测sle和aps患者血栓再发风险，是aps“分类标准”的重要补充指标，推荐与aps/pt igm联合检测，可有效提高血清阴性抗磷脂综合征（snaps）的检出率，也可作为狼疮抗凝物的替代检测，有助于识别狼疮肾炎患者中血栓事件、神经精神狼疮、狼疮活动等风险。

5、目前应用较多的是来自沃芬公司的aps/pt酶联免疫吸附法试剂盒，其采用板式酶促化学发光技术，存在样本检测时间长、操作复杂、样本检测通量低和应用场景窄等缺点。而常见的磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物基本都是通过非共价结合形成aps/pt，其稳定性不佳，与抗体结合效果有待提高，其包被磁微粒性能不佳，进而导致制备的化学发光检测试剂的检测灵敏度和检测结果准确定不好，这是抗aps/pt抗体化学发光检测试剂盒没有被广泛推广利用的主要原因。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种稳定性更好、灵敏度更高、检测结果准确度更高的用于抗aps/pt抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂。

2、为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、一种用于抗aps/pt抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂，所述的磁微粒化学发光试剂由包被磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物的磁珠和保护液组成，所述的包被磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物的磁珠通过以下方法制备得到：

4、（1）先采用磷脂酶a2对磷脂酰丝氨酸进行水解反应，然后将所述的水解反应的产物先与n-羟基琥珀酰亚胺和n,nʹ-二异丙基碳二亚胺进行活化反应，再将所述的活化反应的产物与3-叠氮基-1-丙胺反应，得到预处理的磷脂酰丝氨酸；

5、（2）将凝血酶原与戊炔酸stp酯反应得到预处理的凝血酶原；

6、（3）步骤（1）的预处理的磷脂酰丝氨酸和步骤（2）的预处理的凝血酶原在抗坏血酸和cu(ii)-tbta络合物存在的条件下反应得到磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物；

7、（4）将步骤（3）的磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物包被到磁珠上，

8、所述的保护液为含有1.5wt%~2.5wt% bsa、0.4wt‰~0.6wt‰ 吐温-20、100mm~200mm nacl、2wt%~5wt%蔗糖、0.4wt‰~0.6wt‰ proclin 300的15mm~25mm tris缓冲液，所述的保护液的ph值为7.0~7.4。

9、具体地，步骤（1）中，所述的水解反应在叔丁醇和水的混合液中进行，所述的叔丁醇和水的体积比为1：（4.5~5.5），使用碱性物质调节所述的混合液的ph值为7.5~8.5。

10、具体地，步骤（1）中，所述的水解反应在35℃~38℃恒温条件下进行。

11、具体地，步骤（1）中，所述的活化反应在室温条件下进行。

12、具体地，步骤（1）中，活化反应的产物与3-叠氮基-1-丙胺的反应在室温避光条件下进行。

13、具体地，步骤（2）中，凝血酶原与戊炔酸stp酯的反应在ph值为8.0~8.5且浓度为0.05m~0.15m的碳酸盐缓冲液中进行。

14、具体地，步骤（2）中，凝血酶原与戊炔酸stp酯的反应在2℃~6℃条件下进行。

15、具体地，步骤（2）中，采用脱盐柱对反应得到预处理的凝血酶原进行纯化处理。

16、具体地，步骤（3）中的反应在室温及无氧条件下进行。

17、具体地，步骤（3）中，采用离心取沉淀、冷丙酮清洗沉淀的方式对反应得到的磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物进行纯化处理。

18、具体地，步骤（4）中，采用n-羟基琥珀酰亚胺和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐预激活磁珠，然后将预激活的磁珠与所述的磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物反应，反应结束后，采用浓度为80mm~120mm的甘氨酸溶液封闭，过滤，取磁珠，与所述的保护液混合得到所述的磁微粒化学发光试剂。

19、具体地，所述的包被磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物的磁珠在所述的保护液中的浓度为0.2mg/ml~0.5mg/ml。

20、本发明还提供一种抗aps/pt抗体化学发光检测试剂盒，所述的抗aps/pt抗体化学发光检测试剂盒包括所述的磁微粒化学发光试剂、碱性磷酸酶标记的抗人igg抗体试剂、样本稀释液、存储有标定数据和/或标准曲线的id卡或抗aps/pt抗体标准品。

21、优选地，所述的抗aps/pt抗体标准品包括浓度为150u/ml的标准品、浓度为75u/ml的标准品、浓度为37.5u/ml的标准品、浓度为18.75u/ml的标准品和浓度为9.4u/ml的标准品。

22、优选地，所述的样本稀释液为含有2.5wt%~3.5wt% 酪蛋白、100mm~200mm nacl、3mm~5mm cacl2、1.5wt%~2.5wt% 蔗糖、0.4wt‰~0.6wt‰ proclin 300的40mm~60mm hepes缓冲液，所述的样本稀释液的ph值为7.0~7.4。

23、本发明的抗aps/pt抗体化学发光检测试剂盒灵敏度和准确度高，所需临床样本用量极少，检测通量高且操作简单，仅需一台全自动化学发光免疫分析仪即可实现信号的检测及浓度值转换。本发明的抗aps/pt抗体化学发光检测试剂盒生产周期短，设备要求不高，易于实现量产化。本发明的抗aps/pt抗体化学发光检测试剂盒还具有检测时间短、操作简单、使用便捷、对人员技术水平要求低、应用场景广等优势。

24、本发明与现有技术相比具有如下优势：

25、本发明的磁微粒化学发光试剂中的包被磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物的磁珠稳定性好，使用其制备的抗aps/pt抗体化学发光检测试剂盒重复性好、灵敏度高且准确性高。