抗凝血药物的生物学活性检测方法与流程

本公开涉及到抗体药物的生物学活性检测领域，更具体地说涉及抗凝血因子xi(factor xi，fxi)或其活化形式xia(factor xia，fxia)的抗体及其抗原结合片段的体外生物学活性检测方法。

背景技术：

1、血栓性疾病不仅发病率高，而且致死率和致残率也很高。抗凝血药物是有效防治血栓性疾病的药物。凝血级联反应是系列凝血因子相继被激活，最终形成纤维蛋白的过程。凝血级联反应由内源途径(又称为接触激活途径)和外源途径(又称组织因子途径)启动，再经共同途径生成纤维蛋白。fxi是维持内源途径所必需的，并且在凝血级联反应放大过程中发挥关键作用。因此针对fxi靶点的药物，可阻断内源途径，抑制凝血级联反应的放大，从而起到抗血栓形成的作用。

2、体内高水平的凝血因子xi与血栓形成事件相关，抗fxi/fxia抗体是一种有效预防或治疗血栓形成的药物，其通过结合血液中的凝血因子xi或其活化形式xia阻止内源性凝血途径，从而达到抗凝血的目的。作为对抗体药物有效性的质量评价或质量控制的方法之一，对抗fxi/fxia单克隆抗体的体外生物学活性进行测定具有重要意义。

3、抗fxi/fxia抗体生物学活性测定通常采用活化部分凝血活酶时间(aptt)法。aptt法通常使用凝血仪测定系列浓度抗体的凝血时间，绘制抗体浓度与凝血时间的曲线，进而计算供试品的生物学活性。用凝血仪测定抗体生物活性需要对系列浓度的样品及对照品分批测定，往往测定一个样品用时较长，对于8通道凝血仪大需要2小时，而且大多数生物药分析实验室不具备凝血仪，而酶标仪是实验室常用仪器。本公开中，我们使用酶标仪代替凝血仪，根据系列浓度抗体在相同作用时间凝血的不同程度，测定透射光od值。当血浆没有凝固时，透射光od值最小；当血浆完全凝固时，透射光od值达到最大；当血浆在凝固过程中时，在一定范围内透射光od值与凝血时间成线性相关(r2>0.99，参见附图1、2)。因此凝血过程的od值可以反映血浆凝固的程度。通过测定在一定反应时间下抗体系列浓度的凝血od值，绘制抗体系列浓度与od值的量效反应曲线，该曲线反映了抗fxi/fxia抗体的抗凝血作用，通过与标准品(或对照品)的比较，从而可计算抗fxi/fxia抗体供试品的生物学活性。酶标仪法测定一个样品(含对照品)大只需要20分钟，较凝血仪法大大缩短了时间，对于样品数量较多时，前者优势更加显著。

4、本公开的目的在于提供一种抗fxi/fxia抗体生物学活性检测方法，该方法用酶标仪替代传统方法的凝血仪对抗fxi/fxia抗体生物学活性进行分析，并且简化了实验操作，缩短了实验周期，提高了检测效率。

技术实现思路

1、本公开涉及一种操作时间短、准确性高、重复性好的抗fxi/fxia抗体的活性检测方法。

2、本公开提供一种抗凝血药物的活性检测方法，该方法包括以下的步骤：

3、(a)将供试品和对照品用缓冲液按比例稀释成系列浓度；

4、(b)加入血浆，孵育；

5、(c)加入aptt试剂，孵育；

6、(d)加入cacl2；和

7、(e)于酶标仪上读取od值，根据检测数据计算供试品的相对生物学活性。

8、一些实施方案中，上述抗凝血药物为抗体，例如为抗fxi/fxia抗体、抗fxii/fxiia抗体、抗fix抗体、抗fx抗体、抗fvii抗体、抗fviii抗体、抗血小板糖蛋白iib/iiia受体抗体。

9、一些实施方案中，上述供试品和对照品为抗凝血药物，例如为抗fxi/fxia抗体、抗fxii/fxiia抗体、抗fix抗体、抗fx抗体、抗fvii抗体、抗fviii抗体、抗血小板糖蛋白iib/iiia受体抗体、肝素、阿斯匹林、水蛭素、秋水仙碱、替罗非班、西洛他唑、噻氯吡啶。

10、在一些实施方案中，所述供试品和对照品为相同的抗凝血药物，例如相同的抗fxi/fxia抗体。

11、在一些实施方案中，所述活性检测方法还进一步包含步骤(f)加入edta溶液，终止反应，所述在步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间。

12、在一些实施方案中，进一步地，所述步骤(f)中的edta溶液的浓度为约15mm至约50mm，例如约15mm至约45mm、约15mm至约40mm、约15mm至约35mm、约15mm至约30mm、约15mm至约25mm、约20mm至约50mm、约20mm至约45mm、约20mm至约35mm、约20mm至约30mm、约17mm至约27mm、约25mm至约30mm、约25mm至约35mm。在一些非限制性实施方案中，所述步骤(f)中的edta溶液的浓度为约15mm、约20mm、约21mm、约22mm、约23mm、约24mm、约25mm、约26mm、约27mm、约28mm、约29mm、约30mm、约40mm或约50mm。在一些实施方案中，进一步地，所述步骤(f)中的edta溶液的浓度为约25mm。

13、在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的缓冲液为tris-hcl缓冲液。

14、在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的缓冲液浓度为约20mm至约100mm，例如约20mm至约90mm、约30mm至约80mm、约40mm至约70mm、约45mm至约60mm、约50mm至约55mm、约25mm至约95mm、约35mm至约85mm、约45mm至约75mm、约55mm至约65mm、约20mm至约70mm、约20mm至约50mm、约30mm至约60mm、约40mm至约60mm、约45mm至约55mm。在一些非限制性实施方案中，其中所述步骤(a)中的缓冲液浓度为20mm、约30mm、约40mm、约50mm、约60mm、约70mm、约80mm、约90mm或约100mm。在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的缓冲液浓度为约50mm。

15、在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的缓冲液的ph值为约6.0至约8.5，例如约6.0至约8.0、约6.0至约7.5、约6.5至约8.5、约6.5至约8.0、约6.5至约7.5、约7.0至约8.0、约7.0至约7.5、约7.0至约7.4、约7.2至约7.4(7.3±0.1)。在一些非限制性实施方案中，所述步骤(a)中的缓冲液的ph值为约6.0、约6.5、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.5。在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的缓冲液的ph值为7.3±0.1。

16、在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的缓冲液可以含有有色物质，其包括但不限于台盼蓝、亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝、甲苯胺蓝、碱性蓝、伊红、结晶紫、中性红、詹纳斯绿b、番红，并且所述有色物质不影响抗体与抗原的反应以及凝血过程。在一些实施方案中，进一步地，所述有色物质包括但不限于台盼蓝。

17、进一步地，所述步骤(a)中的缓冲液中的有色物质含量为约0.001％至约0.005％，例如0.001％、约0.002％、约0.003％、约0.004％、约0.005％。

18、在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的供试品和对照品用缓冲液按比例稀释，该稀释比例选自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128中任意一个或多个。

19、在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)中的稀释成系列浓度，所述系列浓度可以包括但不限于约200μg/ml、约100μg/ml、约50μg/ml、约25μg/ml、约12.5μg/ml、约6.25μg/ml、约3.13μg/ml、约1.56μg/ml、约0.781μg/ml、约0.391μg/ml、约0.195μg/ml、约0.0977μg/ml。一些实施方案中，可以增减一些浓度，比如，可以去掉最高和/或最低浓度点：200μg/ml、0.0977μg/ml，注意增减浓度不会影响最终曲线拟合的完整性。

20、在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(b)中的血浆可以是但不限于人血浆。

21、在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(c)中需加入等体积的aptt试剂。

22、在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(b)和(c)中的孵育条件为约20℃至约37℃，例如约20℃、约23℃、约25℃、约27℃、约30℃、约32℃、约35℃、约37℃；约500rpm至约2000rpm转速，例如约500rpm、800rpm、900rpm、1000rpm、1100rpm、1200rpm、1500rpm、2000rpm；孵育1min至30min，例如1min至30min、1min至20min、1min至10min、3min至10min。

23、在一些具体实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(b)中的孵育条件为约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育10min。

24、在一些具体实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(c)中的孵育条件为约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育3min。

25、在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(d)中的cacl2溶液的浓度为约1mm至约30mm，例如约1.0mm、约5.0mm、约10.0mm、约11.0mm、约12.0mm、约12.1mm、约12.2mm、约12.3mm、约12.4mm、约12.5mm、约12.6mm、约12.7mm、约12.8mm、约12.9mm、约13.0mm、约15.0mm、约20.0mm、约30.0mm。在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(d)中的cacl2溶液的浓度为约12.5mm。

26、在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(e)中的od值是在340±20nm处60秒至180秒读取获得，例如340nm处60秒、340nm处90秒、340nm处120秒、340nm处150秒、340nm处180秒、320nm处60秒、320nm处90秒、320nm处120秒、320nm处150秒、320nm处180秒、360nm处60秒、360nm处90秒、360nm处120秒、360nm处150秒、360nm处180秒，但不限于此。在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(e)中的od值是在340nm处90秒读取获得。

27、在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中，所述步骤(e)中的供试品的相对生物学活性是通过将检测数据进行四参数方程拟合，分别计算出供试品和对照品的ec50值，再根据对照品ec50值与供试品ec50值的比值计算出供试品的相对生物学活性。

28、在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)至(d)和(f)中的供试品和对照品、血浆、aptt试剂、cacl2溶液和edta溶液的加入体积相同，所述加入体积为约20至约50μl/孔，例如约25至约50μl/孔、约30至约50μl/孔、约35至约50μl/孔、约40至约50μl/孔、约20至约45μl/孔、约25至约40μl/孔、约30至约35μl/孔、约20至约30μl/孔。在一些非限制性实施方案中，所述加入体积为约20μl/孔、约25μl/孔、约30μl/孔、约35μl/孔、约40μl/孔、约45μl/孔、约50μl/孔。在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述步骤(a)至(d)和(f)中的供试品和对照品、血浆、aptt试剂、cacl2溶液和edta溶液的加入体积为约25μl/孔。

29、在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：

30、所述重链可变区包含分别如seq id no：7、8、9所示的hcdr1、hcdr2、hcdr3，和所述轻链可变区包含分别如seq id no：10、11、12所示的lcdr1、lcdr2、lcdr3。

31、在一些实施方案中，其中所述抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段可选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，例如人源化抗体。

32、在可选实施方案中，其中所述的人源化抗fxi/fxia抗体轻链和重链可变区上的轻链和重链fr序列分别来源于人种系轻链和重链的fr或其突变序列。

33、在一些实施方案中，其中所述抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区和轻链可变区，其中：

34、重链可变区序列如seq id no：5或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如seq id no：6或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列；

35、重链可变区序列如seq id no：13或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如seq id no：14或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列；

36、重链可变区序列如seq id no：15或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如seq id no：16或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列；

37、重链可变区序列如seq id no：17或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如seq id no：16或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列；

38、在一些具体实施方案中，其中所述抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区序列如seq id no：17所示，和所述轻链可变区序列如seq id no：16所示。

39、在一些实施方案中，所述抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。在可选的实施方案中，所述重链恒定区选自人igg1、igg2、igg3、igg4、igg4p(即igg4的s241p突变体)恒定区，所述轻链恒定区选自人κ和λ链恒定区。所述igg4pfc(即包含s241p的igg4 fc)的序列例如seq id no：19所示。在一些实施方案中，所述重链ch1的序列如seq id no：18所示或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，和/或所述轻链恒定区的序列如seq id no：20所示或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列。

40、在一些实施方案中，所述抗fxi/fxia抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中：所述重链具有seq id no：21所示的序列或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，和所述轻链具有seq id no：22所示的序列或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列。

41、本公开中，所述“至少90％同一性”涵盖至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。

42、在一些具体实施方案中，其中所述抗fxi/fxia抗体包含抗体重链和轻链，其中：所述重链序列如seq id no：21所示，和所述轻链序列如seq id no：22所示。

43、在一些实施方案中，如上任一项所述的活性检测方法，其中所述抗fxi/fxia抗体的抗原结合片段为fab、fv、sfv、fab’、f(ab’)2、线性抗体、单链抗体、scfv、sdab、sdfv、纳米抗体、肽抗体peptibody、结构域抗体和多特异性抗体(双特异性抗体、diabody、triabody和tetrabody、串联二-scfv、串联三-scfv)，例如具体为scfv、fv、fab或fab’片段。

44、本公开提供一种抗fxi/fxia抗体的活性检测方法，该方法包括以下的步骤：

45、(a)将供试品和对照品用缓冲液按比例稀释成系列浓度；

46、(b)加入血浆，孵育；

47、(c)加入aptt试剂，孵育；

48、(d)加入cacl2；和

49、(e)于酶标仪上读取od值，根据检测数据计算供试品的相对生物学活性；

50、其中，所述供试品和对照品为抗fxi/fxia抗体；

51、可选地，可进一步包含步骤(f)加入edta溶液，终止反应，所述在步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间。

52、具体实施方案一，该方法包括以下的步骤：

53、(a)将供试品和对照品用ph值为约6.0至约8.5的约20mm至约100mm tris-hcl缓冲液按比例稀释成系列浓度，优选ph值为约7.3±0.1的约50mm tris-hcl缓冲液；

54、(b)加入血浆，孵育；

55、(c)加入aptt试剂，孵育；

56、(d)加入约12.5mm cacl2；和

57、(e)于酶标仪上340nm处90秒读取od值，根据检测数据计算供试品的相对生物学活性。

58、其中，所述供试品和对照品为抗fxi/fxia抗体；

59、可选地，可进一步包含步骤(f)加入edta溶液，终止反应，所述在步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间，其中edta溶液的浓度为约15mm至约50mm，优选为约25mm；

60、可选地，步骤(a)中缓冲液可以含有约0.001％至约0.005％台盼蓝作为有色物质，优选约0.002％；

61、可选地，步骤(a)中稀释比例选自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128中任意一个或多个；

62、可选地，步骤(b)和(c)中的孵育条件为约20℃至约37℃，约500rpm至约2000rpm转速下孵育1min至30min；

63、可选地，步骤(a)至(d)和(f)中的供试品和对照品、血浆、aptt试剂、cacl2溶液和edta溶液的加入体积相同，所述加入体积为约20至约50μl/孔，优选约25μl/孔。

64、可选地，步骤(e)中的供试品的相对生物学活性是通过将检测数据进行四参数方程拟合，分别计算出供试品和对照品的ec50值，再根据对照品ec50值与供试品ec50值的比值计算出供试品的相对生物学活性。

65、可选地，抗fxi/fxia抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含分别如seq id no：7、8、9所示的hcdr1、hcdr2、hcdr3，和所述轻链可变区包含分别如seqid no：10、11、12所示的lcdr1、lcdr2、lcdr3。

66、具体实施方案二，该方法包括以下的步骤：

67、(a)将供试品和对照品用ph值为约7.3±0.1的约50mm tris-hcl缓冲液按比例稀释成系列浓度；

68、(b)加入血浆，约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育10min；

69、(c)加入aptt试剂，约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育3min；

70、(d)加入约1mm至约30mm cacl2溶液，优选约12.5mm；和

71、(e)于酶标仪上340nm处90秒读取od值，根据检测数据计算供试品的相对生物学活性。

72、其中，所述供试品和对照品为抗fxi/fxia抗体；

73、可选地，可进一步包含步骤(f)加入edta溶液，终止反应，所述在步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间，其中edta溶液的浓度为约15mm至约50mm，优选为约25mm；

74、可选地，步骤(a)中缓冲液可以含有约0.001％至约0.005％台盼蓝作为有色物质，优选约0.002％；

75、可选地，步骤(a)中稀释比例选自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128中任意一个或多个；

76、可选地，步骤(a)至(d)和(f)中的供试品和对照品、血浆、aptt试剂、cacl2溶液和edta溶液的加入体积相同，所述加入体积为约20至约50μl/孔，优选约25μl/孔。

77、可选地，步骤(e)中的供试品的相对生物学活性是通过将检测数据进行四参数方程拟合，分别计算出供试品和对照品的ec50值，再根据对照品ec50值与供试品ec50值的比值计算出供试品的相对生物学活性。

78、可选地，抗fxi/fxia抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含分别如seq id no：7、8、9所示的hcdr1、hcdr2、hcdr3，和所述轻链可变区包含分别如seqid no：10、11、12所示的lcdr1、lcdr2、lcdr3。

79、具体实施方案三，该方法包括以下的步骤：

80、(a)将供试品和对照品用ph值为约7.3±0.1的约50mm tris-hcl缓冲液按比例稀释成系列浓度；

81、(b)加入血浆，约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育10min；

82、(c)加入aptt试剂，约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育3min；

83、(d)加入约12.5mm cacl2溶液；和

84、(e)于酶标仪上340±20nm处60秒至180秒读取od值，根据检测数据计算供试品的相对生物学活性；

85、其中，所述供试品和对照品为抗fxi/fxia抗体；

86、可选地，可进一步包含步骤(f)加入edta溶液，终止反应，所述在步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间，其中edta溶液的浓度为约15mm至约50mm，优选为约25mm；

87、可选地，步骤(a)中缓冲液可以含有约0.001％至约0.005％台盼蓝作为有色物质，优选约0.002％；

88、可选地，步骤(a)中稀释比例选自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128中任意一个或多个；

89、可选地，步骤(a)至(d)和(f)中的供试品和对照品、血浆、aptt试剂、cacl2溶液和edta溶液的加入体积相同，所述加入体积为约20至约50μl/孔，优选约25μl/孔。

90、可选地，步骤(e)中的供试品的相对生物学活性是通过将检测数据进行四参数方程拟合，分别计算出供试品和对照品的ec50值，再根据对照品ec50值与供试品ec50值的比值计算出供试品的相对生物学活性。

91、可选地，抗fxi/fxia抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含分别如seq id no：7、8、9所示的hcdr1、hcdr2、hcdr3，和所述轻链可变区包含分别如seqid no：10、11、12所示的lcdr1、lcdr2、lcdr3。

92、具体实施方案四，该方法包括以下的步骤：

93、(a)将供试品和对照品用ph值为约7.3±0.1的约50mm tris-hcl缓冲液按比例稀释成系列浓度，所述稀释比例选自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128中任意一个或多个；

94、(b)加入血浆，约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育10min；

95、(c)加入aptt试剂，约25℃±2℃、约1000rpm转速下孵育3min；

96、(d)加入约12.5mm cacl2溶液；和

97、(e)于酶标仪上340nm处90秒读取od值，通过将检测数据进行四参数方程拟合，分别计算出供试品和对照品的ec50值，再根据对照品ec50值与供试品ec50值的比值计算出供试品的相对生物学活性；

98、其中，所述供试品和对照品为抗fxi/fxia抗体；

99、可选地，可进一步包含步骤(f)加入edta溶液，终止反应，所述在步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间，其中edta溶液的浓度为约15mm至约50mm，优选为约25mm；

100、可选地，步骤(a)中缓冲液可以含有约0.001％至约0.005％台盼蓝作为有色物质，优选约0.002％；

101、可选地，步骤(a)中稀释后的系列浓度选自约200μg/ml、约100μg/ml、约50μg/ml、约25μg/ml、约12.5μg/ml、约6.25μg/ml、约3.13μg/ml、约1.56μg/ml、约0.781μg/ml、约0.391μg/ml、约0.195μg/ml、约0.0977μg/ml中任意一个或多个；

102、可选地，步骤(a)至(d)和(f)中的供试品和对照品、血浆、aptt试剂、cacl2溶液和edta溶液的加入体积相同，所述加入体积为约20至约50μl/孔，优选约25μl/孔。

103、可选地，抗fxi/fxia抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含分别如seq id no：7、8、9所示的hcdr1、hcdr2、hcdr3，和所述轻链可变区包含分别如seqid no：10、11、12所示的lcdr1、lcdr2、lcdr3。

104、具体实施方案五，该方法包括以下的步骤：

105、(a)将供试品和对照品用ph值为约6.0至约8.5的约20mm至约100mm tris-hcl缓冲液按比例稀释成系列浓度；

106、(b)加入血浆，约20℃至约37℃，约1000rpm转速下孵育1min至30min；

107、(c)加入aptt试剂，约20℃至约37℃，约1000rpm转速下孵育1min至30min；

108、(d)加入约1mm至约30mm cacl2溶液；和

109、(e)于酶标仪上340±20nm处60秒至180秒读取od值，根据检测数据计算供试品的相对生物学活性；

110、其中，所述供试品和对照品为抗fxi/fxia抗体；

111、可选地，可进一步包含步骤(f)加入edta溶液，终止反应，所述在步骤(f)位于(d)和(e)步骤之间，其中edta溶液的浓度为约15mm至约50mm，优选为约25mm。

112、可选地，步骤(a)中缓冲液可以含有约0.001％至约0.005％台盼蓝作为有色物质，优选约0.002％；

113、可选地，步骤(a)中稀释比例选自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128中任意一个或多个；

114、可选地，步骤(a)至(d)和(f)中的供试品和对照品、血浆、aptt试剂、cacl2溶液和edta溶液的加入体积相同，所述加入体积为约20至约50μl/孔，优选约25μl/孔。

115、可选地，步骤(e)中的供试品的相对生物学活性是通过将检测数据进行四参数方程拟合，分别计算出供试品和对照品的ec50值，再根据对照品ec50值与供试品ec50值的比值计算出供试品的相对生物学活性。

116、可选地，抗fxi/fxia抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含分别如seq id no：7、8、9所示的hcdr1、hcdr2、hcdr3，和所述轻链可变区包含分别如seqid no：10、11、12所示的lcdr1、lcdr2、lcdr3。

117、本公开中所使用的抗fxi/fxia抗体包括但不局限于上述具体实施方案中的抗fxi/fxia抗体。

118、本公开数据处理采用四参数方程进行拟合，回归方程为：y＝(a-d)/[1+(x/c)b]+d。其中a为曲线上渐近线估值；b为曲线的斜率；c为ec50值(μg/ml)；d：曲线下渐近线估值。待检样品生物活性按下面公式计算：待检样品生物活性(％)＝对照品ec50(μg/ml)/待检样品ec50(μg/ml)×100。

119、本公开同时提供了抗fxi/fxia抗体的生物学活性测定方法及其在fxi/fxia单克隆抗体质控中的应用。

120、本公开采用竞争抑制的体外酶联免疫吸附法测定抗fxi/fxia抗体的生物学活性具有操作简便、准确度高、质量更可控等优点。

121、本公开提供的检测方法满足专属性、精密度、线性和范围、准确度及耐用性等验证方面的要求，能够有效地应用于抗fxi/fxia抗体生物学活性的检测。

122、本公开还提供一种试剂盒或产品，所述试剂盒包含前述任一项检测方法中的血浆、aptt试剂、cacl2溶液和酶标仪。

123、本公开还提供了前述任一项抗凝血药物的活性检测方法、试剂盒或产品在质量放行中的应用。