电化学和光电化学双模式适配体传感器的制作方法

本发明涉及一种电化学和光电化学双模式适配体传感器，属于适配体传感器。

背景技术：

1、青霉素g(pg)，头孢菌素，碳青霉烯类或四环素等抗生素已被合成并广泛用于治疗炎症。然而，在畜牧业、家禽饲养和水产养殖中，为了避免细菌感染，经常出现抗生素的过度使用，抗生素可通过粪便排出进入环境，通过肉食转移到人体。因此，它导致严重的环境污染和对人类的严重威胁。pg是一种β-内酰胺类广谱抗生素，它是通过破坏细菌的细胞壁而起到杀菌作用。在煎炸、炖等烹饪过程中，食物中的pg残渣会被部分分解，产生相应的分解产物，对人的生命造成危害。欧盟标准规定牛奶中pg的最大残留限量为4μg·kg-1，中国国家标准规定为50μg·kg-1(gb 31650-2019)。迄今为止，人们已经探索了多种方法对pg进行灵敏检测，包括高效液相色谱-质谱法、固相萃取法、电化学生物传感器、电化学表面等离子体共振法、荧光传感器、免疫传感器等。但传统的分析方法对pg的分析往往存在测定灵敏度低、分析步骤繁琐、设备昂贵等问题。这些缺点使其无法满足食品和水环境中痕量pg的快速、灵敏检测需求。此外，大多数pg的测定仅依赖于单一的检测方法。食品中pg的精确分析在复杂的环境下很难保证准确性。在这方面，将两者结合起来构建双模式传感检测可以克服这一缺点。在除草剂、农药、生物标志物、霉素等的分析中已经建立了多种双模式检测方法，但在微量pg的检测中却鲜有报道。

2、在各种技术中，电化学方法(ec方法)由于其响应快、分析物剂量小、ec设备操作可行、数据分析简单等优点，已被广泛用于许多分析物(如癌症生物标志物、重金属离子、抗生素、生物分子、dna或有毒有害小分子)的测定。与主-客体相互作用直接检测pg的方法相比，通过在敏感平台上吸附被分析物靶向抗体或适配体构建的ec生物传感器，由于pg与相应探针的特异性结合，往往具有较低的检测限和较高的选择性。特别是，无标记电化学生物传感策略由于其构筑的可行性，通常用于pg的灵敏分析。以光和电两种可分离的能量形式分别作为激发源(输入)和检测信号(输出)的光电生物传感器，由于其高灵敏度，在不同抗生素如四环素、土霉素、磺胺甲嗪、硝基呋喃酮、氯霉素、四环素、盐酸阿霉素、硫酸庆大霉素、恩诺沙星等的灵敏性分析中显示出了巨大的潜力。其具有成本低、仪器简化可行、背景噪声低的优点。但目前尚未发现制备用于pg检测的pec生物传感器的报道，考虑到ec和pec技术的优点，若将两种方法相结合，开发ec-pec双模式传感技术，可实现对复杂食品或环境中pg的精确检测。此外，利用指数富集(selex)技术筛选配体系统进化的单链寡核苷酸(aptamer)，在制备高效的检测抗生素的适配体传感器(aptasensors)方面引起了广泛关注。与通过抗原-抗体特异性相互作用开发的免疫传感器相比，适配体传感器往往具有更优异的传感性能，反应速度快，成本低。为了构筑一种优异的ec-pec生物传感器，必须寻求一种传导材料既能传输电子或光电流响应作为测定信号，又能大量锚定生物探针分子。

3、到目前为止，各种纳米材料，如多孔有机聚合物，聚(二烯丙基二甲基氯化铵)功能化石墨烯/ag@au纳米片，ti3c2-金属-有机框架(mofs)，tio2-g-c3n4@aunps，或co-mof-on-tpn共价-有机框架(cof)杂化材料，已被用于构建ec适配体传感器，用于检测抗生素。然而，由于缺乏具有增强ec活性和光电转换效率的功能性纳米材料，目前还没有开发出用于抗生素检测的双模式ec-pec适配体传感器。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种电化学和光电化学双模式适配体传感器，可用于复杂食品或环境中pg等抗生素的精确检测。

2、为了实现以上目的，本发明的所采用的技术方案是：

3、一种电化学和光电化学双模式适配体传感器，包括电极、涂覆在电极表面的电极材料以及锚定在电极材料上的核酸适配体；所述电极材料的制备方法包括以下步骤：将共价三嗪骨架材料和铁盐在铁盐的有机良溶剂中进行分散后，固液分离，然后将所得固体进行干燥处理。

4、本发明的电化学和光电化学双模式适配体传感器所采用的电极材料在制备时，通过将铁盐和共价三嗪骨架材料在溶剂中进行分散，固液分离后对固体进行干燥处理实现电化学活性金属fe对三嗪骨架材料的掺杂。在制备过程中，fe离子转化为β-feooh纳米晶体并包裹在三嗪骨架材料的网络中。共价三嗪基骨架(ctfs)作为pop的一个重要类别，由腈基三聚环构筑单元构成，具有较低的结晶度、显著的化学和热稳定性、高的电化学活性并在紫外-可见光范围内具有出色的光吸收，β-feooh纳米晶体与三嗪骨架材料形成异质结可以显著促进电子转移，增强光生电子与空穴的分离，这使得电极材料表现出突出的电化学(ec)和光电化学(pec)能力，从而显示出作为电化学和光电化学双模式适配体传感器电极材料的巨大潜力，该电极材料可以扩展多孔有机框架在生物传感和环境监测中的应用。本发明的电化学和光电化学双模式适配体传感器，可灵敏、选择性地测定痕量抗生素，在食品安全和环境方面具有广泛的应用前景。

5、本发明的适配体传感器的电极材料上锚定的适配体传感器为青霉素靶向适配体时，电化学和光电化学双模式无标记适配体传感的检出限明显低于wenjuan guo等人在《microchemical journal》和rene welden等人在《electrochemical science advances》中报道的pg生物传感器(此pec和ec技术分别低至0.7和0.08fg·ml-1)，可用于痕量pg的灵敏检测。

6、进一步地，所述共价三嗪骨架材料由三聚氰胺和2,5-二羟基对苯二甲醛进行反应形成；所述三聚氰胺和2,5-二羟基对苯二甲醛的质量之比为8:100～20:100，优选为8:100～15:100，例如为10:100。以三聚氰胺(ma)和2,5-二羟基对苯二甲醛(dha)为构建单元得到的三嗪骨架材料具有更为丰富的丰富、更高的孔隙率以及更为优异的光吸收性能，而引入fe离子能够使提高电极材料的电化学活性，这些都使得最终得到的电极材料(fe-ma-dha-ctf)具有较高的光电转换效率和良好的电化学活性。采用三聚氰胺和2,5-二羟基对苯二甲醛进行反应形成的三嗪骨架材料(ma-dha-ctf)的适配体传感器在不需要任何ec或pec指示剂的情况下，检测pg时显示放大的传感信号。此外，三嗪骨架材料(ma-dha-ctf)具有稳定的化学结构，可以使得到的电极材料(fe-ma-dha-ctf)具有较高的稳定性，进而使适配体传感器具有高灵敏度、高选择性和良好的稳定性，以及出色的重现性、再生性和可接受的适用性。

7、进一步地，所述分散是将铁盐和共价三嗪骨架材料的悬浮液混合后进行搅拌处理；所述悬浮液是将共价三嗪骨架材料分散在所述良溶剂中形成；所述搅拌处理的时间为8～12h，例如为10h。

8、进一步地，所述铁盐为醋酸铁、硝酸铁、氯化铁中的一种或任意组合；所述铁盐的良溶剂为醇类溶剂。采用醇类溶剂具有分散性好的优点。进一步地，所述共价三嗪骨架材料与铁盐的质量之比为10:35～60:35，优选为40:35～60:35，例如为50:35；控制三嗪骨架材料和铁盐的质量比在该范围能够提供合适的掺杂量。每50mg的共价三嗪骨架材料对应采用的有机良溶剂的体积为10～30ml，优选为20ml。所述醇类溶剂优选为甲醇。

9、进一步地，所述干燥处理为真空干燥处理。所述干燥处理的温度为40～80℃，优选为60℃，时间为4～8h，优选为6h。

10、进一步地，所述共价三嗪骨架材料采用包括以下步骤的方法制得：将三聚氰胺和2,5-二羟基对苯二甲醛的混合溶液在150～200℃反应48～96h，例如在180℃反应72h，固液分离后，将所得固体进行洗涤、干燥。进一步地，混合溶液中每10mg三聚氰胺对应2.0～4.0ml溶剂，例如10mg三聚氰胺对应3.2ml溶剂。所述混合溶液的溶剂优选为二甲基亚砜。

11、进一步地，所述混合溶液是将三聚氰胺的有机溶液和三聚氰胺和2,5-二羟基对苯二甲醛的有机溶液进行混合得到。所述三聚氰胺的有机溶液是将三聚氰胺溶解在二甲基亚砜中得到。每10mg三聚氰胺对应采用的二甲基亚砜的体积为1.6ml。所述2,5-二羟基对苯二甲醛的水溶液是将2,5-二羟基对苯二甲醛溶解在二甲基亚砜得到。每100mg 2,5-二羟基对苯二甲醛对应采用的二甲基亚砜的体积为1.6ml。

12、进一步地，所述电极为玻碳电极。玻碳电极的导电性好，并且具有较好的惰性，化学稳定性高。

13、电极材料吸附的大量核酸适配体可以使电化学和光电化学双模式适配体传感器具有较高的选择性，并根据检测对象选择对应抗生素靶向的核酸适配体。为实现对青霉素的检测，所述核酸适配体为青霉素靶向适配体。所述青霉素靶向适配体优选为5′-ggg tctgag gag tgc gcg gtg cca gtg agt-3′。

14、由于本发明的适配体传感器采用的电极材料具有较高的光电转换效率和良好的电化学活性，对靶向核酸适配体具有较高的生物亲和力，并且响应速度快，采用青霉素靶向核酸适配体的适配体传感器在1fg·ml-1-10ng·ml-1的pg浓度范围内，采用电化学(ec)和光电化学(pec)法的检测下限分别为0.08和0.7fg·ml-1，同时检测pg具有选择性高、稳定性好、重复性好的优点，在不同的真实样品中具有广泛的适用性。

15、进一步地，本发明的电化学和光电化学双模式适配体传感器采用包括以下步骤的方法制得：将电极材料涂覆在电极表面，得到修饰电极，然后将核酸适配体锚定在修饰电极上，然后进行封闭处理，即得。

16、进一步地，在电极表面涂覆电极材料前，对电极表面进行预处理；所述预处理是对表面进行抛处理，洗涤、干燥后进行电活化处理。所述电活化处理是采用循环伏安法在0.5mh2so4中以100mv·s-1在-1.0-1.0v范围内对电极表面进行扫描活化直到获得稳定的循环伏安曲线，然后对电极表面进行洗涤，后进行干燥。

17、进一步地，将电极材料涂覆在电极表面的方法，包括以下步骤：将电极材料的分散液涂覆在电极表面，干燥后清洗电极表面，干燥；所述电极材料的分散液中电极材料的浓度为0.1～2.0mg·ml-1，例如为1.0mg·ml-1。

18、进一步地，将核酸适配体锚定在修饰电极上的方法，包括以下步骤：将修饰电极在核酸适配体溶液中进行孵育处理，然后清洗除去松散吸附的核酸适配体；所述核酸适配体为青霉素靶向核酸适配体。所述核酸适配体溶液中核酸适配体的浓度为10～500nmol·l-1，例如为100nmol·l-1。所述孵育处理的时间为10～80min，例如为60min。

19、进一步地，所述青霉素靶向核酸适配体为5′-ggg tct gag gag tgc gcg gtg ccagtg agt-3′。

20、通过封闭处理可以消除干扰物与修饰电极之间的非特异性吸附。进一步地，封闭处理时采用的封闭剂为质量分数为1％的牛血清白蛋白(bsa)溶液。进一步地，封闭处理时将锚定核酸适配体的修饰电极浸入封闭剂中进行孵育处理。封闭处理过程中进行的孵育处理的时间为30min。