高效液相色谱法检测盐酸戊乙奎醚注射液有关物质的方法与流程

本发明属于药物分析检测方法，具体涉及一种高效液相色谱法检测盐酸戊乙奎醚注射液有关物质的方法。

背景技术：

1、盐酸戊乙奎醚，英文名称为penehyclidine hydrochloride，化学名称为3-(2-环戊基-2-羟基-2-苯基乙氧基)奎宁环烷盐酸盐，分子式为c20h29no2·hcl，分子量为351.92，cas号为87827-02-9，结构式如下：

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3、盐酸戊乙奎醚注射液属注射剂，商品名为长托宁，为选择性抗胆碱药，主要用于麻醉前给药以抑制唾液腺和气道腺体分泌及有机磷毒物(农药)中毒急救治疗和中毒后期或胆碱酯酶(che)老化后维持阿托品化。

4、盐酸戊乙奎醚注射液中的有关物质可能来源于两个方面，工艺杂质和降解杂质，其中部分工艺杂质和降解杂质的结构经确定如表1所示：

5、表1盐酸戊乙奎醚杂质谱分析汇总表

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8、经过文献检索，各大药典均未对该品种进行收载，仅有盐酸戊乙奎醚原料药新药转正标准(ws1-(x-026)-2004z)中采用薄层色谱法对有关物质项进行控制，但薄层色谱法检测的准确性受温度、湿度、点样技术等多种因素的影响，操作误差大，重现性差，且该标准中仅控制了2个已知杂质，杂质限度为0.25％，不能满足日益提高的对药品杂质严格控制的要求。

9、目前，在对盐酸戊乙奎醚的杂质分析检测方法中，多是针对一至两种杂质的分析，盐酸戊乙奎醚的杂质谱来源包含工艺杂质和降解杂质，杂质a和杂质b为工艺杂质；盐酸戊乙奎醚在酸性和强氧化条件下不稳定，易发生降解，主要的降解杂质包含杂质r、杂质c、杂质s和基因毒性杂质环戊基苯基乙醛。

10、关于杂质b、杂质c和杂质s的分析方法未见文献报道。现有技术中对杂质a和杂质r的分析中，其流动相为磷酸二氢钾缓冲盐和乙腈体系，对上述杂质不能全部检出。因此，亟需寻找一种准确有效、灵敏度高、重现性好、一次上样即可实现多个杂质同时检测的盐酸戊乙奎醚有关物质的检测方法，以实现对产品质量的精准控制。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高效液相色谱法检测盐酸戊乙奎醚注射液有关物质的方法，操作简便，各杂质峰面积的相对标准偏差小于4.6％，精密度良好，各杂质的回收率在89.8％～101.5％之间，准确度高，各杂质间分离度不小于2.3，分离度良好，可同时对6个已知杂质进行控制，有效控制盐酸戊乙奎醚注射液的产品质量，保证临床用药的安全有效，解决现有技术中对盐酸戊乙奎醚注射液有关物质检测灵敏度不高，杂质检出不全的问题。

2、为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种高效液相色谱法检测盐酸戊乙奎醚注射液有关物质的方法，包括以下步骤：

4、利用高效液相色谱仪对供试品溶液进行检测，采用反相c18色谱柱，以体积比为磷酸氢二钾溶液：乙腈＝70:30～90:10的混合液为流动相a，其中，磷酸氢二钾溶液的ph为4.0～5.5且含0.5～1.0vol％三乙胺，以体积比为水:乙腈＝10:90～30:70的混合液为流动相b进行梯度洗脱，色谱柱温度为30～40℃，检测波长为200～270nm，流速为0.8～1.5ml/min；

5、所述有关物质中包括：杂质a、杂质b、杂质c、杂质r和/或杂质s。

6、优选地，所述杂质a为3[2-环戊基-2-苯基-2(2-环戊基-2-羟基-2-苯基乙氧基)乙氧基]奎宁环烷盐酸盐，杂质b为3-(2-羟基-2，2-二苯基乙氧基)奎宁环烷盐酸盐，杂质c为苯基环戊基甲酮，杂质r为1-环戊基-1-苯基-1,2乙二醇，杂质s为3-(2-环戊基-2-羟基-2-苯基乙氧基)奎宁环-1-氧化物。

7、又，所述有关物质包括杂质环戊基苯基乙醛。

8、其中，梯度洗脱程序为：

9、0～5min，流动相a为90％，流动相b为10％；5～25min，流动相a从90％匀速降到70％，流动相b从10％升至30％；25～55min，流动相a从70％匀速降到0％，流动相b从30％升至100％；55～70min，流动相a为0％，流动相b为100％；70～75min，流动相a从0％升到90％，流动相b从100％降至10％，而后继续以流动相a为90％，流动相b为10％平衡5min。

10、优选地，所述反相c18色谱柱柱长250～300mm，填料种类为十八烷基硅烷键合硅胶，填料粒径为3～5μm。

11、优选地，所述色谱柱选自shimadzeu inertsil系列、waters xbridge系列或agilent zorbax系列。

12、更优选地，所述反相c18色谱柱为shimadze inertsil ods-3v，内径为4.6mm×250mm，填料粒径为5μm。

13、进一步，所述高效液相色谱仪的检测器为二极管阵列或者紫外吸收检测器，所述色谱柱温度为35℃，检测波长为206nm，流速为1.0ml/min。

14、又，所述磷酸氢二钾溶液中，磷酸氢二钾的浓度范围为0.015mol/l～0.035mol/l；所述流动相b中，水与乙腈的体积比为20:80。

15、又，所述供试品溶液为盐酸戊乙奎醚注射液，或所述供试品溶液为浓度不低于1mg/ml的盐酸戊乙奎醚溶液，包括盐酸戊乙奎醚原料药或其制剂。

16、进一步，所述高效液相色谱仪的样品进样盘温度为4～8℃。

17、本发明中，通过对盐酸戊乙奎醚及其有关物质的性质进行研究，得知盐酸戊乙奎醚及其杂质s分别以非对映异构体形态存在，由于非对映异构体化学性质的相似性导致了其在液相分离上的的困难，且杂质s与盐酸戊乙奎醚结构类似，进一步增加了分离难度，此外，杂质c在供试品溶液中稳定性差，也影响了杂质的准确定量检测。

18、发明人在对盐酸戊乙奎醚的检测方法开发过程中发现，流动相ph值会影响杂质的分离，本发明在合适ph值条件下，调整洗脱梯度，在盐酸戊乙奎醚和杂质s的洗脱时间段内保持较缓的梯度变化，保证各峰之间良好分离；对于杂质c，通过控制进样盘温度来保证杂质c在样品检测期间的稳定性，从而保证了检测结果的准确性；此外，由于盐酸戊乙奎醚及其多个杂质结构中的氮原子会和色谱柱中的残余硅醇基作用会导致峰拖尾，为了解决该问题，本发明一方面在流动相a中采用了性质较为稳定的磷酸氢二钾改善峰型，另一方面通过添加适量的三乙胺进一步抑制峰拖尾，在两方面的配合作用下，进一步改善了分离度，体系ph稳定，保证了各杂质的准确定量。

19、本发明中，筛选了合适的hplc检测条件，以体积比为磷酸氢二钾溶液：乙腈＝70:30～90:10的混合液为流动相a，其中，磷酸氢二钾溶液的ph为4.0～5.5且含0.5～1.0vol％三乙胺，以体积比水:乙腈＝10:90～30:70为流动相b进行梯度洗脱，配合本发明的色谱柱条件，可使以非对映异构体形态存在的盐酸戊乙奎醚及其杂质s，以及杂质a、杂质b、杂质c和杂质r均能分离，具有良好的分离度，且精密度良好，各杂质的回收率在89.8％～101.5％之间，准确度高。

20、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

21、本发明中对盐酸戊乙奎醚注射液有关物质的分析方法操作简便，可同时对6个已知杂质进行控制，其中，对杂质a、杂质b、杂质c、杂质r和杂质s可进行定性定量检测，通过加校正因子的主成分自身对照法计算出各杂质的具体含量，且检测结果重复性好，保障了盐酸戊乙奎醚注射液成品质量的可控性，对基因毒性杂质环戊基苯基乙醛进行定性检测。

22、本发明的检测方法准确度高，分离度良好，通过加样回收试验，得到各杂质的回收率在89.8％～101.5％之间，各杂质峰面积的相对标准偏差小于4.6％，精密度良好(双人，共12份样品)，低、中、高三种浓度下均准确可控，重复性好，灵敏度高，且各杂质之间分离度良好，各峰之间的分离度不低于2.3，结果可信度高，为严格控制盐酸戊乙奎醚注射液的质量，提高质量标准提供了可靠的检验基础。