一种基于GO-CDTPA-AuNPs和PET-RAFT的电致化学发光检测试剂盒

本发明涉及一种基于go-cdtpa-aunps复合材料和光致电子/能量转移可逆加成-片段链转移(pet-raft)多信号放大策略的电致化学发光检测试剂盒及使用方法和应用，属于生物分析。

背景技术：

1、非小细胞肺癌(non-small-cell carcinoma，nsclc)发生率占肺癌的80％～85％，20～25％的nsclc患者存在kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viraloncogene，kras)突变。其中kras g12c(g→t)占nsclc中kras突变的40％，且kras g12c突变的nsclc患者生存率较低。早期nsclc可通过手术成功切除，中晚期可通过放化疗治疗。然而近年来，肺癌的传统化疗未见突破性进展，且不良反应严重。因此，开发一种对kras g12灵敏检测的方法对诊断nsclc患者的致癌因素和患者的治疗手段具有重要意义。

2、目前已经报道了几种检测kras突变的方法：液体活检分析技术、双脱氧测序、数字聚合酶链反应(dpcr)、定量聚合酶链反应(qpcr)、二代测序(ngs)等。但是，在检测过程中仍存在假阳性、耗时长、需要专门仪器和专业的操作人员等缺点。而电致化学发光法兼具化学发光和电化学两种方法的优点，如灵敏度高、精确度高、成本较低、操作简便等，因而得到广泛应用。

3、此外，联合利用纳米材料和聚合反应等信号放大技术可以提高传感器的检测性能。其中，氧化石墨烯(go)作为一种化学修饰的石墨烯片状纳米材料，具有极大的比表面积、良好的生物相容性和多个与氧相关的官能团，如基面的羟基和环氧化物以及平面边缘的羧基。然而，由于π-π键相互作用，容易发生团聚，幸运的是，可以通过在石墨烯层之间引入纳米金(aunps)来有效解决。凭借这些特性，go具有更多的活性位点和独特的催化活性，在很多领域引起了广泛关注。近年来，光引发聚合因其具有良好的经济效益和生态预期而备受关注。其中，pet-raft聚合在适用性、成本和可持续性方面优于其他光化学技术。pet-raft聚合的核心是其简便性和能源效率，因为它只需要低能量的可见光源并且可以在室温下进行，该聚合物可以在氧气存在下合成，而且不需要重金属催化剂。因此研究一种基于go-cdtpa-aunps复合材料和pet-raft多信号放大策略的电致化学发光传感平台具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于go-cdtpa-aunps复合材料和pet-raft多信号放大策略的新型电致化学发光测试剂盒及使用方法和应用，结合了纳米材料的优点和自由基聚合的多功能性和便利性，避免了传统raft反应中重金属离子催化剂的使用，使信号得到成倍的放大，提高检测的灵敏度，稳定性和重现性。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：

3、一种基于go-cdtpa-aunps和pet-raft的电致化学发光检测试剂盒，包括以下原料：金电极、hdna、mch、mpa-nhs酯、go-cdtpa-aunps、me6tren、ey、nas、鲁米诺、pbs缓冲液和h2o2。

4、进一步，mpa-nhs酯的制备方法为将等摩尔的edc、nhs、mpa混合均匀并在37℃下反应3h，得到浓度为1mm的mpa-nhs酯溶液。

5、进一步，go-cdtpa-aunps的制备方法为：

6、①将20mg go溶解在10ml超纯水中并超声处理，得到go分散液；

7、②将20mg eta和20mg koh分散在go分散液中，反应，离心并洗涤，真空干燥，得到eta修改的go，即go-eta；

8、③将2mg cdtpa、1.6mg edc、1mg nhs均匀混合在5ml dmf中，反应，得到cdtpa-nhs酯溶液；

9、④将5mg go-eta、0.2mg dmap溶解在5ml cdtpa-nhs酯溶液中，反应，离心，收集沉淀物并用1ml超纯水重新分散，得到go-cdtpa分散液；

10、⑤将1mm aunps溶液和go-cdtpa分散液以体积比2：3混合均匀，反应，离心，收集沉淀物并用超纯水重新分散，得到go-cdtpa-aunps分散液。

11、进一步，①的超声处理时间为30min；②的反应条件为80℃搅拌24h；③的反应条件为在37℃反应15～24h；④的反应条件为在黑暗的室温条件下反应24h；⑤的反应条件为在室温下搅拌12h。

12、进一步，部分原料使用时需配制成溶液，其中，hdna溶液的浓度为0.5μm，mch溶液的浓度为2mm，mpa-nhs酯溶液的浓度为1mm，me6tren溶液的浓度为1.2mm，ey溶液的浓度为0.02mm，nas溶液的浓度为10mm，鲁米诺溶液的浓度为10mm，pbs缓冲液的浓度为0.1m，ph＝7.4，h2o2溶液的浓度为10mm。

13、本发明的技术方案之一是：一种电致化学发光检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

14、(1)电极预处理

15、裸金电极进行打磨获得抛光镜面；

16、(2)电极修饰

17、①将hdna溶液滴到电极表面，反应；

18、②将步骤①的电极浸入mch溶液中，反应；

19、③将待检测溶液直接滴到步骤②的电极表面，反应；

20、④将步骤③电极浸泡在mpa-nhs酯溶液中，反应；

21、⑤将go-cdtpa-aunps分散液滴到步骤④的电极表面，反应；

22、⑥将步骤⑤的电极放置在me6tren溶液、ey溶液、nas溶液和pbs缓冲液组成的混合溶液中，反应；

23、⑦将步骤⑥的电极放置在鲁米诺溶液中，反应；

24、⑧将步骤⑦的电极放置在h2o2中测量鲁米诺的发光强度。

25、进一步，①的反应温度为37℃，时间为2～8h；②的反应温度为37℃，时间为0.5～1h；③的反应温度为37℃，时间为1.5～2h；④的反应温度为37℃，时间为1～2h；⑤的反应温度为37℃，时间为1～3h；⑥的反应条件为室温，470nm蓝光照射，2h；⑦的反应温度为37℃，时间为1～3h。

26、本发明的技术方案之一是：一种所述的试剂盒在制备检测肺癌试剂中的应用。

27、进一步，所述肺癌为非小细胞肺癌

28、本发明检测方法原理示意图如图1所示。

29、本发明采用go-cdtpa-aunps复合材料和pet-raft多信号放大策略。首先，将发卡dna(hdna)探针通过自组装的极性共价键连接到电极表面，6-巯基己醇(mch)关闭残余结合位点后，将目标dna(tdna)通过特异性识别连接到电极表面。通过酰胺反应，将mpa和hdna-nh2相连接。而后通过au-s键自组装将go-cdtpa-aunps复合材料与mpa相连接。随后在蓝光的照射条件下，通过pet-raft反应将大量的单体nas与链转移剂cdtpa相连，为发光材料鲁米诺提供许多结合位点，从而明显地放大了ecl信号。最后，许多鲁米诺分子通过氨基缩合反应与大量的nas紧密相连。

30、pet-raft过程以cdtpa为链转移剂、ey为催化剂、me6tren为配体，在470nm光照射下进行了nas的聚合。还原猝灭途径在特定波长的蓝光激发下开始，随着光子的吸收，电子从基态(ey)过渡到激发态(ey*)。之后，ey*在剥夺电子供体(nr3，me6tren)的同时产生ey·-和nr3·+。基于三种催化剂(ey、ey*和ey·－)，建立了一个可逆循环来调节photo-atrp的还原和猝灭途径。激活pet-atrp的链转移剂(cdtpa)，同时产生自由基(pn·)，随后与还原的raft试剂相互作用，产生休眠的大分子raft物质，从而关闭催化循环。通过上述还原猝灭反应，将大量的单体接枝到电极表面。然后，将单体与鲁米诺结合进行ecl检测。过氧化氢在鲁米诺ecl反应中是一种有效的共反应物，它倾向于分解为超氧自由基(oh·)和超氧阴离子自由基(o2·－)。在施加一定的电压下，鲁米诺和共反应物过氧化氢同时被氧化，然后过氧化氢迅速分解生成高能自由基中间体(参与鲁米诺的氧化反应，使鲁米诺成为激发态，后鲁米诺从激发态回到基态同时产生相应波长的光)。值得注意的是go和aunps在放大鲁米诺的ecl信号方面起着重要作用，go将增加修饰电极的界面面积，通过正负电荷与pet-raft的相互作用捕获更多的aunps和鲁米诺；而aunps将促进电极界面的电子转移，在电极和化学反应态产物中催化鲁米诺的ecl过程，从而使ecl信号得到高度放大。

31、本发明有益效果：

32、本发明利用go-cdtpa-aunps复合材料和pet-raft多信号放大策略，避免了目前常用信号放大策略中生物酶(易受到外界环境和温度影响等)的使用，信号得到成倍的放大，提高检测的灵敏度，稳定性和重现性。

33、本发明采用go-cdtpa-aunps复合材料和pet-raft多信号放大策略，不仅避免了鲁米诺通过π-π共轭与go结合的不稳定性，而且提高了go的表面利用率，这将进一步提高鲁米诺的电化学发光效率。将go和aunps相结合避免了传统纳米材料结合不稳定，易于聚集的缺点，光引发的raft聚合反应避免了传统raft反应中对热引发的需求，反应条件温和，反应时间更快，在室温下即可实现“活性”/可控聚合；且不会产生生物毒性，更加环保。