一种用于判断肿瘤免疫环路重建的细胞因子/趋化因子Panel的制作方法

本发明属于肿瘤体外免疫检测，涉及一种用于判断肿瘤免疫环路重建的细胞因子/趋化因子panel。

背景技术：

1、免疫治疗不仅具有较好的抗癌效果，而且副作用问题较少。因此，免疫治疗也被称为第四抗癌治疗方法。但是由于肿瘤能通过各种各样的逃避机制避过患者免疫系统的识别和杀伤, 使相当一大部分患者的免疫治疗效果很不理想。

2、众所周知，由癌细胞、血管、淋巴、成纤维细胞、炎症细胞以及多种细胞外基质有机构成的肿瘤微环境（tme）对癌症患者的免疫调节起重要作用。而，肿瘤源性细胞因子和趋化因子是影响tme中免疫细胞功能的重要因素。因为在不同tme中，免疫细胞会分泌相对应的具有抗肿瘤或促肿瘤作用的细胞因子/趋化因子，从而影响患者的免疫治疗效果。但是，目前肿瘤免疫环路重建缺少特异性检测手段，无法有效鉴别在癌症免疫治疗过程中免疫反应和免疫干扰情况，严重阻碍了对患者肿瘤免疫环路重建情况的判断，不仅影响了患者早期免疫治疗的策略制定，而且延误了治疗无效患者进入二线治疗或个性化免疫治疗环状rna药物定制治疗的时机，让患者白白承受了不必要的免疫治疗和可能的免疫治疗副作用。

3、有鉴于此，本发明申请人公开了一种可用于判断癌症患者免疫治疗过程中肿瘤免疫环路重建情况的细胞因子/趋化因子panel。本发明申请不仅丰富了现有肿瘤免疫环路重建情况的检测技术，而且为改善癌症患者免疫治疗、提高肿瘤免疫类药物和个性化定制环状rna肿瘤免疫治疗药物的临床获益提供了践行依据。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题在于癌症患者免疫治疗过程中肿瘤免疫环路重建情况检测技术的不足，提供一种可以克服上述问题或者部分地解决上述问题的用于判断肿瘤免疫环路重建和为改善免疫治疗提供践行依据的细胞因子/趋化因子panel，从而改善癌症患者的免疫治疗质量和提高肿瘤免疫类药物的临床获益。

2、为了达到上述目的，本发明采用技术方案的基本构思是：通过在同一癌症样本上检测多种细胞因子/趋化因子，确定相关癌症免疫治疗过程中的免疫反应和免疫干扰情况，实现监控癌症患者的肿瘤免疫环路重建情况。其中，用于判断肿瘤免疫环路重建的细胞因子/趋化因子panel，其所包含有的细胞因子为：il-2、il-7、il-12sc、il-15sushi、il21、il-23、il-36γ、gm-csf、ifn-α、ifn-γ；其所包含有的趋化因子为：ccl3、ccl5、ccl13、ccl19、ccl21、cxcl9、cxcl10、cxcl11、xcl1、cx3cl1。

3、进一步地，所述癌症样本包括有细胞，组织，血清，血浆和培养上清。

4、进一步地，所述细胞因子/趋化因子的panel包括有捕获组分、检测组分和报告组分。

5、进一步地，所述捕获组分包括有若干自带不同强度荧光且大小均一的荧光编码基质；

6、优选地，所述荧光编码基质包括有磁珠微球，羧基修饰的聚苯乙烯微球，羟基修饰的聚苯乙烯微球，氨基修饰的聚苯乙烯微球，氨基修饰的聚丙烯酸微球，羧基修饰的二氧化硅微球，羟基修饰的二氧化硅微球，氨基修饰的二氧化硅微球，羧基修饰的石墨烯微球，羟基修饰的石墨烯微球，氨基修饰的石墨烯微球，羧基修饰的氮化硼微球，羟基修饰的氮化硼微球，氨基修饰的氮化硼微球，羧基修饰的石墨烯纳米片，羟基修饰的石墨烯纳米片，氨基修饰的石墨烯纳米片，羧基修饰的氮化硼纳米片，羟基修饰的氮化硼纳米片，氨基修饰的氮化硼纳米片。

7、进一步地，所述捕获组分包括有细胞因子细胞因子为：il-2、il-7、il-12sc、il-15sushi、il21、il-23、il-36γ、gm-csf、ifn-α、ifn-γ；其所包含有的趋化因子为：ccl3、ccl5、ccl13、ccl19、ccl21、cxcl9、cxcl10、cxcl11、xcl1、cx3cl1的探针分子，并固定于所述捕获组分自带荧光的基质上；所述探针分子可与检测样品中的特定物质结合；所述探针分子分别为细胞因子细胞因子为：il-2、il-7、il-12sc、il-15sushi、il21、il-23、il-36γ、gm-csf、ifn-α、ifn-γ；其所包含有的趋化因子为：ccl3、ccl5、ccl13、ccl19、ccl21、cxcl9、cxcl10、cxcl11、xcl1、cx3cl1的高度特异性捕获单克隆抗体；

8、优选地，所述高度特异性捕获单克隆抗体与所述荧光编码基质的包被比例为1微克至10微克探针分子包被1×106个荧光编码微球或1×105片荧光编码纳米片。

9、进一步地，所述检测组分包括有检测抗体混合液。所述检测抗体混合液制备的步骤如下：首先用二甲亚砜溶解生物素制备生物素/二甲亚砜溶液，随后加入待标记的细胞因子为：il-2、il-7、il-12sc、il-15sushi、il21、il-23、il-36γ、gm-csf、ifn-α、ifn-γ；其所包含有的趋化因子为：ccl3、ccl5、ccl13、ccl19、ccl21、cxcl9、cxcl10、cxcl11、xcl1、cx3cl1的检测抗体并混匀，于室温避光孵育后，加入tris-hcl再于室温避光孵育；随后用脱盐柱除去未反应的生物素，并进行稀释以获得生物素标记的检测抗体混合液；

10、优选地，所述检测抗体包括有鼠抗人抗体、羊抗人抗体或兔抗人抗体；

11、优选地，所述检测抗体混合液制备过程中所述检测抗体与所述生物素的摩尔比为1/15-1/20；

12、优选地，所述检测抗体混合液中制备过程中所述tris-hcl与所述生物素的体积比为0.9-1.1。

13、进一步地，所述报告组分包括有链霉亲和素与荧光标记染料偶联形成的报告试剂。所述报告试剂制备的步骤如下：首先用交联剂分别活化链霉亲和素和荧光标记染料，随后将活化链霉亲和素和荧光标记染料进行混合反应和纯化，并用蛋白稀释液稀释制备成浓度为1微克每毫升的报告试剂；

14、优选地，所述荧光标记染料为包括有藻红蛋白、别藻蓝蛋白、异硫氧酸荧光素、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物、罗丹明、四甲基罗丹明、香豆素、 氟硼二吡咯、吲哚菁绿、cy3、cy3 .5、cy5、cy5 .5、cy7、cy7 .5、alexa fluor 594、alexa fluor 488、alexa fluor532、pe-cy5、pe-cy5.5或pe-cy7；

15、优选地，所述链霉亲和素的交联剂包括有n-羟基琥珀酰亚胺酯，马来酰亚胺，磺基琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，n-ε-马来酰亚胺基己酰-氧琥珀酰亚胺酯；

16、优选地，所述荧光标记染料的交联剂包括有琥珀酰亚胺-4-(n-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯），n-乙基马来酰胺，琥珀酰亚胺 3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯，琥珀酰亚胺 -6(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)已酸酯，4-甲酰基苯甲酸琥珀酰亚胺基酯。

17、进一步地，所述报告组分包括有标准品。所述标准品制备的步骤如下：首先混合细胞因子为：il-2、il-7、il-12sc、il-15sushi、il21、il-23、il-36γ、gm-csf、ifn-α、ifn-γ；其所包含有的趋化因子为：ccl3、ccl5、ccl13、ccl19、ccl21、cxcl9、cxcl10、cxcl11、xcl1、cx3cl1的标准品制备标准品溶液,然后通过nibsc标准品对标准品溶液各个组成的浓度进行校准并用蛋白保存液稀释至终浓度10000皮克每毫升，最后通过冻干机冻干细胞因子/趋化因子的标准品溶液制成冻干粉；所述冻干粉作为标准品；所述标准品作为具有梯级浓度的所述细胞因子/趋化因子标准品混合液的配置原料。

18、进一步地，本发明提供了上述细胞因子/趋化因子panel在癌症免疫治疗过程中鉴别免疫反应和识别免疫干扰情况的应用技术方案；

19、优选地，所述应用技术方案中的细胞因子包括il-2、il-7、il-12sc、il-15sushi、il21、il-23、il-36γ、gm-csf、ifn-α、ifn-γ；

20、优选地，所述应用技术方案中的趋化因子包括ccl3、ccl5、ccl13、ccl19、ccl21、cxcl9、cxcl10、cxcl11、xcl1、cx3cl1。

21、进一步地，本发明提供了提供上述panel在预测肿瘤免疫药物疗效中的应用技术方案；

22、优选地，所述应用技术方案中的细胞因子包括il-2、il-7、il-12sc、il-15sushi、il21、il-23、il-36γ、gm-csf、ifn-α、ifn-γ；

23、优选地，所述应用技术方案中的趋化因子包括ccl3、ccl5、ccl13、ccl19、ccl21、cxcl9、cxcl10、cxcl11、xcl1、cx3cl1；

24、优选地，所述肿瘤免疫药物包括有pd-1抑制剂，pd-l1抑制剂，ctla-4抑制剂，mrna药物，环状rna药物。

25、本发明人用于判断肿瘤免疫环路重建的细胞因子/趋化因子panel是通过以下技术方案来实现的：具体包括以下几个步骤：

26、第一步，在处理好的组织样本中同时标记细胞因子：il-2、il-7、il-12sc、il-15sushi、il21、il-23、il-36γ、gm-csf、ifn-α、ifn-γ和趋化因子：ccl3、ccl5、ccl13、ccl19、ccl21、cxcl9、cxcl10、cxcl11、xcl1、cx3cl1；或在处理好的液体样本中依次加入细胞因子：il-2、il-7、il-12sc、il-15sushi、il21、il-23、il-36γ、gm-csf、ifn-α、ifn-γ和趋化因子：ccl3、ccl5、ccl13、ccl19、ccl21、cxcl9、cxcl10、cxcl11、xcl1、cx3cl1的捕获组分，检测组分和报告试剂；

27、第二步，对第一步步骤中所述细胞因子和趋化因子进行颜色比对和数据采集；

28、第三步，对组织样本计算肿瘤区和非肿瘤区中各细胞类群的数量；对液体样本根据报告组分中具有梯级浓度的所述细胞因子/趋化因子标准品混合液确定癌症患者各细胞类群的数量。

29、进一步地，作为优选的技术方案，在上述技术方案第一步步骤中对所述细胞因子和所述趋化因子的具体操作方式如下：

30、首先，对所述组织样本的标记细胞因子和趋化因子分别搭配对应的特异性染料；或对液体样本中的标记细胞因子：il-2、il-7、il-12sc、il-15sushi、il21、il-23、il-36γ、gm-csf、ifn-α、ifn-γ和标记趋化因子：ccl3、ccl5、ccl13、ccl19、ccl21、cxcl9、cxcl10、cxcl11、xcl1、cx3cl1分别搭配对应的高度特异性捕获单克隆抗体，检测抗体及荧光标记染料；

31、其次，在荧光测量系统中对每种荧光信号进行采集，让不同的细胞因子/趋化因子荧光信号强弱可以区分不同的细胞类群。

32、进一步地，作为优选的技术方案，在上述技术方案第二步步骤中对所述细胞因子和所述趋化因子颜色比对和采集的具体操作方式如下：

33、il-2作为cd4+t细胞的标记；il-7为骨髓基质细胞的标记；il-12sc为炎性细胞的标记；il-15sushi为单核－巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞

34、的标记；il-21为cd4+t细胞的标记；通过il-23 对树突状细胞进行标记；il-36γ作为cd8+t细胞的标记；gm-csf对粒细胞和巨噬细胞进行标记；ifn-a和ifn-γ作为白细胞的标记；ccl3和ccl5作为 cd8+ t细胞的标记；ccl13作为t细胞的标记；ccl19为树突状细胞和t细胞的标记；ccl21为淋巴内皮细胞的标记；cxcl9作为cd8+t细胞的标记；cxcl10为单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞的标记；cxcl11作为嗜酸性粒细胞的标记；xcl1作为cd8+t细胞和自然杀伤细胞的标记；cx3cl1为巨噬细胞、中性粒细胞和上皮细胞的标记。

35、进一步地，作为优选的技术方案，在上述技术方案第三步步骤中的具体操作方式如下：对组织样本来说，同时监控肿瘤组织中肿瘤区和非肿瘤区中各细胞类群数量的多种免疫细胞；

36、对液体样本来说，在反应平板中每孔加入捕获组分，与平板结合后洗板，随后加入处理好的检测试样、标准品、空白样品，孵育，之后加入检测组分，孵育后洗板。再加入报告试剂，孵育，洗板后上机读取结果；或在装在流式管中处理好的检测试样中依次加入捕获组分和检测组分并混匀，孵育，之后加入报告试剂，孵育后，洗涤弃上清，再加入洗液涡旋振荡上机读取结果。

37、进一步地，一种用于判断肿瘤免疫环路重建的细胞因子/趋化因子panel的优选应用技术方案为肿瘤免疫药物疗效预测应用，具体如下：

38、在患者接受大剂量肿瘤免疫药物治疗4天后于第7天提取肿瘤组织或抽取外周血，对肿瘤组织或提取的血清进行panel检测，读取检测结果，如果上述细胞因子/趋化因子中有75%的细胞因子/趋化因子数量或浓度升高，可判定为肿瘤免疫药物治疗有效。

39、进一步地，一种用于判断肿瘤免疫环路重建的细胞因子/趋化因子panel的优选应用技术方案为可编程环状rna肿瘤免疫药物的个体化定制，具体如下：

40、在患者接受大剂量肿瘤免疫药物治疗4天后于第7天提取肿瘤组织或抽取外周血，对肿瘤组织或提取的血清进行panel检测，读取检测结果，如果上述细胞因子/趋化因子中数量或浓度升高的细胞因子/趋化因子比例低于25%，可判定为肿瘤免疫药物治疗效果有限，建议进行可编程环状rna肿瘤免疫药物的个体化定制治疗。

41、本发明的有益效果是：

42、第一，提供一种用于判断肿瘤免疫环路重建情况的细胞因子/趋化因子panel，克服目前肿瘤免疫环路重建缺少特异性检测手段的问题，从而可以在癌症免疫治疗过程中鉴别免疫反应和免疫干扰情况，实现癌症患者肿瘤免疫环路重建情况的监控；

43、第二，提供上述panel在预测环状rna药物疗效中的应用，根据细胞因子/趋化因子浓度变化即可早期预测患者免疫治疗效果，对治疗无效患者可早期进入二线治疗或个性化免疫治疗环状rna药物定制，避免不必要的免疫治疗，从而免于承受其副作用，克服目前缺少环状rna肿瘤类免疫药物疗效预测指标的问题；

44、第三，相较于仅能观察一种细胞类群而无法区分各细胞亚群状态和判定各细胞类群间相互关系的传统肿瘤免疫环路重建判断技术，本发明提供的一种肿瘤免疫环路重建的细胞因子/趋化因子panel极大提高了肿瘤免疫环路重建的检测深度和检测可靠性，融合患者的随访信息，可为癌症患者的个性化免疫治疗用药定制及改善其临床治疗质量发挥积极作用。与此同时，本发明所提供的一种肿瘤免疫环路重建的细胞因子/趋化因子panel具有高度覆盖各免疫细胞类群和结合肿瘤标志物，检测肿瘤细胞与免疫细胞相互关系以及样本原位标记方案等特点。