羌活或宽叶羌活的特征图谱构建方法及其鉴别方法与流程

本发明涉及中药鉴别领域，特别是涉及一种羌活或宽叶羌活的特征图谱构建方法及其鉴别方法。

背景技术：

1、羌活收载于中国药典2020年版一部，来源为伞形科植物羌活notopterygiumincisum ting ex h.t.chang或宽叶羌活notopterygium franchetii h.de boiss.的干燥根及根茎。其辛，苦，温。归膀胱、肾经。解表散寒，祛风除湿，止痛。用于风寒感冒、头痛项强、风湿痹痛以及肩背酸痛。羌活为常用中药，始载于《神农本草经》，基原为伞形科羌活属(notopterygium)的植物，是我国最早发现和应用的药用植物之一。中国药典2020年版收载的药用羌活品种有两种，分别是伞形科植物羌活和宽叶羌活。羌活(羌活)药材商品主要为蚕羌和竹节羌，质量为佳。宽叶羌活(羌活)药材商品为大头羌、条羌和疙瘩羌，习惯认为质量较次。各药材中的异欧前胡素、阿魏酸与羌活醇的含量比较结果为蚕羌>竹节羌>条羌>大头羌。

2、羌活的化学成分主要为挥发油、香豆素类、聚烯炔类、倍半萜类以及酚酸类，还有甾体、黄酮等化学成分，另外还有酰胺类、糖类以及有机酸类。目前，李英梅等建立了药材羌活的高效液相色谱指纹图谱，确立了15个共有峰，并且对其中5个色谱峰进行了指认，其中包括apterin、紫花前胡苷、白芷内酯、佛手柑内酯与异佛手柑内酯；刘志刚等建立了羌活的hplc指纹图谱，评价不同来源羌活药材的内在质量，根据结果建立了羌活药材的色谱指纹图谱共有模式，标定了17个共有峰，其中包括绿原酸、阿魏酸与紫花前胡苷。通过对不同产地药材的指纹图谱研究发现，不同来源的羌活药材指纹图谱相似度差异较大，固定产地羌活样品的相似度均在0.90以上，其余样品的相似度均小于0.80。王海波等建立了不同来源的中药羌活hplc-荧光指纹谱，得到20个共有指纹色谱峰，确定了基准样本色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，各羌活样品与基准样本相似度值均在0.8以上，从而构建羌活的高效液相-荧光指纹图谱质控方法等。

3、中国药典2020年版第一部除了性状并无记载“羌活”和“宽叶羌活”药材在特征图谱或者含量相关能够区分的项目，而性状项下规定对于粉碎后的药材粉末参考意义不大。对此有研究人员利用羌活成分的差异为切入点，对羌活药材的两种基原“羌活”和“宽叶羌活”进行了区别研究。例如，张志锋通过高效液相色谱法和电喷雾质谱法联用对标识化合物进行检测，基于6种化学成分并结合opls-da分析，建立了区别羌活种类的方法。但是，该检测方法需要使用到昂贵的质谱设备，并预先利用多批次样品建立样品库，再结合统计学分析才能判定结果，难以用于建立鉴别标准，并且经查阅文献暂无找到主要区别成分6-o-丙二酸紫花前胡苷与对羟基苯乙基阿魏酸酯的相关信息，也未提供相关指认信息。王倩等建立了不同基源羌活药材的超高效液相色谱含量测定及指纹图谱分析方法，结合聚类分析、pca及opls-da将30批羌活样品分为两类，并筛选出羌活醇、异欧前胡素等10个对组分差异影响较大的成分，但除了羌活醇与异欧前胡素，其它主要差异峰暂未得到指认。张远芳等建立了羌活与宽叶羌活的hplc指纹图谱，利用指纹图谱相似度评价能有效区分羌活的基原与真伪，但只能指认出成分羌活醇与异欧前胡素，其它主要差异峰未能进行指认。综上，上述鉴别方法均需要结合统计学软件，与“羌活”或者“宽叶羌活”参照物进行比较，并未对差异成分进行深入研究。虽然，吴方斌等建立了红外光谱快速鉴别羌活和宽叶羌活两种基原植物药材的方法，但红外光谱无法对二者化学成分进行指认。因此，亟待建立一种能够快速且有效区分羌活和宽叶羌活的鉴别方法。

技术实现思路

1、基于此，本发明提供了一种羌活或宽叶羌活的特征图谱构建方法，其构建的图谱信息丰富、特征性强，可简单快速地对羌活与宽叶羌活进行区分。

2、本发明通过如下技术方案实现。

3、一种羌活或宽叶羌活的特征图谱构建方法，包括如下步骤：

4、取阿魏酸对照品与6'-o-(反式阿魏酰基)-紫花前胡苷对照品，制备混合对照品溶液；

5、取羌活药材或宽叶羌活药材，制备羌活供试品溶液或宽叶羌活供试品溶液；

6、将所述羌活供试品溶液或宽叶羌活供试品溶液，以及所述混合对照品溶液进行超高效液相色谱测定；

7、超高效液相色谱测定的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为甲酸水溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序包括：0min～5min，流动相a的体积百分数从10％变化至13％，5min～6min，流动相a的体积百分数从13％变化至14％，6min～20min，流动相a的体积百分数保持为14％，20min～30min，流动相a的体积百分数从14％变化至25％，30min～36min，流动相a的体积百分数从25％变化至50％，36min～39min，流动相a的体积百分数从50％变化至60％，39min～44min，流动相a的体积百分数从60％变化至80％，44min～46min，流动相a的体积百分数从80％变化至95％，46min～50min，流动相a的体积百分数保持为95％。

8、在其中一个实施例中，所述甲酸水溶液中，甲酸的体积分数为0.01％～0.03％。

9、在其中一个实施例中，超高效液相色谱测定的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃±2℃；流速为0.25ml/min±0.02ml/min；波长为330nm±5nm。

10、在其中一个实施例中，制备混合对照品溶液包括如下步骤：

11、将所述阿魏酸对照品、6'-o-(反式阿魏酰基)-紫花前胡苷对照品与甲醇混合。

12、在其中一个实施例中，制备羌活供试品溶液或宽叶羌活供试品溶液包括如下步骤：

13、将所述羌活药材与甲醇水溶液混合，加热回流提取，然后过滤，取滤液；或

14、将所述宽叶羌活药材与甲醇水溶液混合，加热回流提取，然后过滤，取滤液。

15、在其中一个实施例中，甲醇水溶液中，甲醇的体积分数为40％～60％。

16、本发明还提供一种羌活与宽叶羌活的鉴别方法，包括如下步骤：

17、取待测物，进行超高效液相色谱测定，将获得的所述待测物的图谱与如上所述的羌活或宽叶羌活的特征图谱构建方法所构建的特征图谱进行比较；

18、其中，超高效液相色谱分析的条件包括：流动相a为乙腈，流动相b为甲酸水溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序包括：0min～5min，流动相a的体积百分数从10％变化至13％，5min～6min，流动相a的体积百分数从13％变化至14％，6min～20min，流动相a的体积百分数保持为14％，20min～30min，流动相a的体积百分数从14％变化至25％，30min～36min，流动相a的体积百分数从25％变化至50％，36min～39min，流动相a的体积百分数从50％变化至60％，39min～44min，流动相a的体积百分数从60％变化至80％，44min～46min，流动相a的体积百分数从80％变化至95％，46min～50min，流动相a的体积百分数保持为95％。

19、在其中一个实施例中，所述甲酸水溶液中，甲酸的体积分数为0.01％～0.03％。

20、在其中一个实施例中，超高效液相色谱测定的条件还包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃±2℃；流速为0.25ml/min±0.02ml/min；波长为330nm±5nm。

21、在其中一个实施例中，所述待测物的图谱中，以阿魏酸对应的色谱峰为参照峰s，计算6'-o-(反式阿魏酰基)-紫花前胡苷对应的色谱峰的相对峰面积；

22、所述相对峰面积小于等于1，所述待测物为羌活；或所述相对峰面积大于1，所述待测物为宽叶羌活。

23、与现有技术相比较，本发明的羌活或宽叶羌活的特征图谱构建方法具有如下有益效果：

24、本发明采用超高效液相色谱法建立羌活或宽叶羌活的特征图谱，通过筛选流动相分别为乙腈与甲酸水溶液，同时限定洗脱方式，最终构建的羌活或宽叶羌活的特征图谱具有13个共有峰的特征图谱，并指认了其中的11个，具体为绿原酸、4-香豆酸、阿魏酸、异紫花前胡苷、紫花前胡苷、异绿原酸b、羌活酚、羌活醇、阿魏酸苯乙醇酯、异欧前胡素与6'-o-(反式阿魏酰基)-紫花前胡苷，图谱信息丰富、特征性强，最重要的是本发明可利用6'-o-(反式阿魏酰基)-紫花前胡苷相对于阿魏酸峰的相对峰面积对“羌活”和“宽叶羌活”两种基原药材进行快速区分，相比于传统区分方法，基于本发明所构建的羌活与宽叶羌活的特征图谱对两者进行区分更为简单，不需结果统计学分析。