一种基于内源性多肽的疾病特征多肽标志物的检测方法

本发明涉及一种基于内源性多肽的疾病特征多肽标志物的检测方法，属于生物医药。

背景技术：

1、组学分子驱动的疾病诊断和监测是临床诊断的新方法，在过去几十年中引起了广泛地关注。然而，基于测序的基因组学和转录组学的疾病检测成本高，基于lc-ms的蛋白质组学和代谢组学的疾病检测耗时长，都不是精准医学时代实现疾病个体化监测的最佳手段。一般来说，在精准医学中筛选特定分子特征的重要前提是快速检测大规模临床样本。在这方面，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(maldi-tof ms)因其快速和高通量的检测能力而备受瞩目。

2、肽组作为低分子蛋白质组，广泛分布在血清中，并与生物体的状态息息相关。目前，许多研究表明肽与疾病的出现和发展相关，已有研究表明多肽可以作为前瞻性疾病标志物。例如，血清淀粉样蛋白a-2，血清淀粉样蛋白a-1，c-反应蛋白能够监测covid-19。纤维蛋白原α链(605-629，m/z 2660)，α-胰蛋白酶抑制剂重链h4(347-356，m/z 1061)，载脂蛋白酶a-ii(43-52，m/z 1041)可作为乳腺癌的血清肽生物标志物。最近，maldi-tof ms已被初步应用于基于内源性多肽分析的疾病诊断，并成功实现了健康人和疾病患者的分类。然而，受限于内源性多肽丰度低、实际样品复杂，目前的工作尚未同时实现对疾病的全面监测。为此，需要开发功能化的纳米材料进行内源性多肽富集，从而提高检测灵敏度。

3、在众多功能化的纳米材料中，铜离子材料由于具备与多肽的羧基和氨基的出色配位能力，可以实现多肽的全方位富集。具有大量邻苯二酚官能团的多巴胺可以在温和的条件下聚合，并粘附到几乎任何材料表面。此外，聚多巴胺可以通过软模板方法调节到高度开放的孔结构，具有充分利用自身官能团进行离子螯合的能力，从而在材料表面固定大量铜离子。因此，有必要通过结合铜离子和介孔聚多巴胺的材料优势，制备一种具有优异多肽配位能力的探针，以便于高效鉴定内源性肽。

4、膜性肾病是一种自身免疫性肾小球疾病，是肾病综合征最常见的病理类型。如果没有精确的诊断和治疗方案，大多数膜性肾病患者将发展为慢性肾脏疾病或终末期肾病，也可能继发系统性红斑狼疮、癌症等其他疾病，面临高死亡率的威胁。目前，抗磷脂酶a2受体(pla2r)和含7a结构域的ⅰ型血小板反应蛋白(thsd7a)是膜性肾病的常见诊断策略，然而其检测灵敏度分别仅为70％和3％。在疾病诊断方面，膜性肾病与其他原发性肾病综合征亚型(如微小病变)具有相似的临床表现和不同的治疗策略，临床中通过采用具有高侵入性和高设备要求的肾活检对两者进行鉴别。在临床预后方面，临床中根据抗pla2r1抗体水平进行预后评估，其使用的药物价格昂贵且具有潜在毒性，仍然存在争议和挑战。因此，有必要开发一种具有高灵敏度和低损伤的先进手段，以实现对膜性肾病的全面个体化监测，包括精确诊断和预后监测。

技术实现思路

1、本发明的目的是为解决如何提供一种基于内源性多肽的疾病特征多肽标志物的检测方法的技术问题。

2、本发明提供一种基于内源性多肽的疾病特征多肽标志物的检测方法，用磁性铜离子介孔多巴胺材料作为固相吸附剂对样品进行内源性肽的分离富集；对分离富集物进行maldi-tof/tof ms分析；对maldi-tof/tof ms质谱图做峰提取和归一化，并进行正交偏最小二乘判别分析和热图分析，获得用于检测疾病的特征多肽标志物；再对分离富集物进行nano-lc-ms/ms分析；将经maldi-tof/tof ms分析所得的特征多肽标志物的质荷比和nano-lc-ms/ms分析鉴别的多肽进行匹配，确定特征多肽标志物的氨基酸序列。

3、优选地，包括以下步骤：

4、步骤1：用磁性铜离子介孔多巴胺材料分离富集样品；将磁性铜离子介孔多巴胺材料与上样缓冲液配置成材料分散液，取材料分散液和目标样品加入上样缓冲液中，用上样缓冲液洗涤，加入洗脱缓冲液，得到洗脱液；

5、步骤2：将步骤1所得洗脱液混合基质点靶，进行maldi-tof/tof ms分析；

6、步骤3：将步骤2所得的maldi-tof/tof ms的质谱图做峰提取和归一化，并进行正交偏最小二乘判别分析和热图分析，选择特征多肽标志物；

7、步骤4：将步骤1所得洗脱液冻干进行nano-lc-ms/ms分析鉴别多肽；

8、步骤5：将步骤3所得的特征多肽标志物的质荷比和步骤4中nano-lc-ms/ms分析鉴别的多肽匹配，确定特征多肽标志物的氨基酸序列。

9、优选地，上述步骤1中使用的磁性铜离子介孔多巴胺材料的合成步骤如下：

10、步骤1.1：将六水合三氯化铁溶解于乙二醇中，至溶液澄清透明后加入无水醋酸钠，充分搅拌超声后转移至反应釜中，在100-450℃下加热10-20小时，反应完毕后待反应釜冷却至室温，用去离子水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于40-75℃下真空干燥；其中，六水合三氯化铁、乙二醇和无水醋酸钠的质量体积比为1.35g：75ml：3.6g；

11、步骤1.2：将步骤1.1所得产物与普朗尼克f127均匀分散于乙醇和去离子水的混合溶液中，在超声均匀后，将1,3,5-三甲苯，盐酸多巴胺，浓氨水分别注入溶液中，室温搅拌2-3小时，反应结束后用水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于60-90℃下用丙酮回流24小时，所得产物于40-75℃下真空干燥；其中，普朗尼克f127，乙醇，去离子水，1,3,5-三甲苯，盐酸多巴胺，浓氨水的质量体积比为200mg：10ml：10ml：0.2ml：120mg：0.16ml；

12、步骤1.3：将步骤1.2所得产物均匀分散于0.1mol/l硫酸铜溶液中，在超声均匀后，室温搅拌2-3小时，用去离子水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于40-75℃下真空干燥。

13、优选地，所述样品包括血清或尿液。

14、本发明提供根据上述的一种基于内源性多肽的疾病特征多肽标志物的检测方法在非诊断方法和非治疗方法上的应用。

15、优选地，上述应用包括在制备疾病检测和疾病预后监测试剂盒中的应用。

16、本发明提供一种膜性肾病的检测或预后监测试剂盒，试剂盒中包括用于检测12条特征多肽标志物的试剂；12条特征多肽标志物的氨基酸序列如seq id no：1-12所示；

17、seq id no：1：yvkvtsiqdwvqktiaen；

18、seq id no：2：ssyskqftsstsynrgdstfesksy；

19、seq id no：3：seaedasllsfmqgymkhat；

20、seq id no：4：dahksevahrfkdlgeenfkalvliaf；

21、seq id no：5：wdldpevrptsavaa；

22、seq id no：6：dahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqy；

23、seq id no：7：eeagarvqqnvpsgtdtgd；

24、seq id no：8：sledkterellesyidg；

25、seq id no：9：spmysiitpnilrlesee；

26、seq id no：10：iaallspysysttavvtnpke；

27、seq id no：11：sssyskqftsstsynrgdstfesksykmadeagseadhegthst；

28、seq id no：12：tfpgffspmlgefvsetesrgsesgiftntkessshhpgiaefpsrg。

29、相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

30、1.本发明提出在磁性介孔多巴胺孔道中固定金属离子，磁性介孔多巴胺具有大比表面积和良好的磁响应性，并且可以充分利用邻苯二酚官能团螯合大量金属离子，因此本发明方法可以更灵敏地分离富集内源性肽。

31、2.磁性铜离子介孔多巴胺材料的铜离子和内源性肽具有优异的配位作用，因此本发明方法在复杂的生物样品中显示出对内源性肽良好的富集能力。

32、3.本发明方法中通过机器学习算法可以分析内源性多肽在健康人和疾病患者之间的表达差异，从而筛选特征多肽标志物，结合nano-lc ms/ms可以大规模鉴定内源性多肽，深入分析生物功能。

33、总之，本发明制备的磁性铜离子介孔多巴胺材料具有大量铜离子和优异的磁响应性，可以成功地用于特异性分离富集膜性肾病患者、微小病变患者、健康人、部分缓解和完全缓解患者血清或尿液中的内源性多肽，并筛选出12条特征内源性多肽为潜在的膜性肾病标志物，成功实现了膜性肾病患者的初步诊断和疾病分类，这表明其在大规模人群筛查、疾病诊断和预后监测方面具有巨大应用前景。