一种唾液酸寡糖的富集方法及检测方法

本发明涉及一种唾液酸寡糖的富集方法及检测方法。

背景技术：

1、唾液酸糖链组成复杂、结构多样、丰度动态范围大，低丰度糖链通常达不到一些分析方法的检出限。其次，糖链为多羟基结构，亲水性强，唾液酸位于n-糖链末端，带有负电荷，在质谱中离子化效率低，检测灵敏度不高。此外，从糖蛋白上酶切糖链的过程不可避免地会引入盐，并使得糖链和肽段及蛋白等分子共存，干扰糖链在质谱中的检测。

2、为解决上述难题，在利用质谱对糖链进行分析前，可对其进行纯化和富集，以减少杂质对糖链质谱分析的干扰和提高质谱对糖链的检测灵敏度，从而实现对糖链的准确定性分析。

3、现有已公开的针对唾液酸寡糖进行富集的方法包含氟化学标签法和葡萄糖苷-希夫碱改性硅胶动态吸附法以及其他一些根据亲水相互作用原理的材料在对n-糖进行富集时可实现对唾液酸寡糖的部分富集。但这些方法存在操作复杂，富集效果不佳等缺点，有必要提供一种材料制备简单，反应条件温和，且提高检测灵敏度的方法。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中对唾液酸糖链检测存在检测灵敏度低、且杂质干扰的缺陷，提供一种唾液酸寡糖的富集方法及检测方法。本发明的富集方法材料制备简单，能够有效富集样本中的唾液酸寡糖。

2、本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题：

3、本发明提供一种唾液酸寡糖的富集方法，其包括如下步骤：

4、将唾液酸寡糖粗品经过改性脱脂棉进行固相萃取；

5、其中，所述改性脱脂棉的制备方法包括如下步骤：将脱脂棉与含环氧基团的铵基阳离子化试剂在碱性条件下进行水热反应，然后调节ph至中性，干燥后制得所述改性脱脂棉。

6、本发明中，在所述改性脱脂棉的制备方法中，所述脱脂棉可选自本领域常规的脱脂棉。

7、本发明中，较佳地，所述含环氧基团的铵基阳离子化试剂为2，3-环氧丙基三甲基氯化铵。

8、本发明中，所述脱脂棉的羟基与所述含环氧基团的铵基阳离子化试剂中的环氧基发生反应。较佳地，所述反应中，含环氧基团的铵基阳离子化试剂的用量过量，以保证尽可能多的修饰上阳离子。

9、本发明中，较佳地，所述水热反应的温度为60～70℃，例如62.5～67.5℃，更佳地，所述水热反应的温度为65℃。

10、本发明中，较佳地，所述水热反应的时间为7～9h，例如7.5～8.5h，再例如8h。

11、在本发明的一些实施例中，所述水热反应为在65℃下搅拌8h进行。

12、本发明中，所述碱性条件可采用本领域常规的碱性物质进行调节，所述碱性物质例如为氢氧化钠。相对于2.5g脱脂棉而言，所述氢氧化钠的用量可以为4～6g，也可以为4.5～5.5g，较佳地，氢氧化钠的用量为5g。

13、本发明中，所述改性脱脂棉的制备方法中，在调节ph至中性之后，还包括干燥的步骤。

14、本发明中，所述唾液酸寡糖粗品可为本领域常规包含唾液酸寡糖的样品，所述含唾液酸寡糖的样品例如可通过含唾液酸寡糖的样品经过切糖实验得到，例如糖蛋白样品经过切糖实验得到。

15、其中，所述糖蛋白样品可包括唾液酸糖肽、胎球蛋白或鸡蛋黄。

16、其中，所述切糖实验可包括如下步骤：将糖蛋白样品经过酶解、蛋白沉淀、离心取上清液。

17、所述酶解所采用的酶可为pngase f糖苷酶。

18、所述酶解采用的酶的用量可以根据样品进行选择，例如可以为1～3μl，也可以为2～4μl。1μl酶可用于处理10～20μg蛋白。

19、所述酶解的反应温度可以为40～70℃，例如为45～55℃，较佳地，所述酶解的反应温度为50℃。

20、所述酶解的反应时间可以为8～12分钟，也可以为9～11分钟，较佳地为10分钟。

21、所述酶解可以为在40～60℃下反应8～12分钟，也可以为在45～55℃下反应9～11分钟，较佳地，在50℃下反应10分钟。

22、在所述蛋白沉淀的步骤中，一般可通过采用有机溶剂进行蛋白沉淀，所述有机溶剂例如为乙腈和冰乙醇。

23、在所述离心的步骤中，较佳地，离心参数设为转速5000～20000g下离心1～15分钟，例如15000g离心5分钟。

24、较佳地，在切糖实验后，还包括如下步骤：将切糖实验得到的唾液酸寡糖样品干燥、复溶于溶剂后得到唾液酸寡糖粗品。

25、所述溶剂可为乙腈，所述乙腈例如为80％乙腈水溶液。本发明中，所述固相萃取可按照本领域常规在固相萃取柱中进行，所述经过改性脱脂棉较佳地包括如下步骤：将唾液酸寡糖粗品上样至装填有所述改性脱脂棉的固相萃取柱中。

26、其中，较佳地，所述固相萃取柱为枪头柱。其中，对于200μl的枪头柱而言，较佳地，所述改性脱脂棉装填的质量可以为4.5～5.5mg，也可以为4.8～5.2mg。本发明中，选用200μl枪头柱最为合适，而棉花的装填量可根据上样量进行调节。

27、其中，较佳地，所述唾液酸寡糖粗品的上样体积为10μl以上，例如15或20μl。

28、其中，在上样之前，还可按照本领域常规对固相萃取柱进行清洗。例如，可依次采用超纯水、纯乙腈、80％acn水溶液进行清洗。

29、本发明中，所述固相萃取可包括如下步骤：将所述唾液酸寡糖粗品上样至固相萃取柱，将固相萃取体系进行离心富集，清洗，洗脱。

30、其中，较佳地，所述离心富集步骤的离心梯度为50g离心2min，550g离心2min，2000g离心1min，循环3次。(其中，50g、550g、2000g是指离心设置的参数转速)

31、其中，较佳地，所述清洗步骤包括如下操作：使用水和80％乙腈在2000g离心1min。

32、其中，所述洗脱使用的洗脱液可以为0.1％tfa(三氟乙酸)，也可以为50mmnh4hco3，也可以为25mm nh4hco3。较佳地为25mm nh4hco3。

33、其中，所述洗脱包括如下步骤：采用25mm nh4hco3水溶液作为洗脱液，然后将所述固相萃取柱分别在50g离心2min，550g离心2min，2000g离心1min，然后取洗脱液。

34、其中，在所述洗脱后，还包括如下步骤：收集洗脱液，真空干燥，作为富集后样品。

35、本发明还提供一种唾液酸寡糖的检测方法，其包括如下步骤：

36、(1)富集：将待测样品采用如前所述的方法进行富集得到富集后样品a；

37、(2)衍生化处理：将所述富集后样品a与衍生化试剂进行衍生化反应得到衍生产物；

38、(3)检测：将所述衍生产物进行液质联用检测(液相色谱质谱联用检测)，液质联用检测的条件如下：流动相包括c相和d相，其中，c相为ph＝4.4含50mm甲酸铵的水溶液，d相为乙腈，以c相和d相的体积百分比为100％计，洗脱梯度如下表：

39、

40、

41、其中，％是指d相占流动相的体积百分比。

42、本发明中，所述待测样品可为含有唾液酸寡糖的样品，例如所述唾液酸寡糖粗品或糖蛋白样品，所述糖蛋白样品例如为唾液酸糖肽、胎球蛋白或鸡蛋黄。

43、本发明中，所述衍生化试剂可选自2-ab，2-aa或本领域能用于增强质谱响应的试剂，较佳地为166.67mg/ml 2-ab溶液。

44、对于唾液酸寡糖粗品选自15μl的1mg/ml唾液酸糖肽标准溶液、50μl的1mg/ml的胎球蛋白或1只新鲜生鸡蛋时，经富集后得到被衍生化的样品，所述衍生化试剂的体积可为3μl、6μl或8μl，较佳地，2-ab溶液体积为6μl。

45、本发明中，较佳地，所述衍生化反应的温度为50～80℃，例如55～75℃，更佳地为65℃。

46、本发明中，较佳地，所述衍生化反应的时间可以为2.5～5小时，也可以为3.5～4小时，更佳地为4小时。

47、在本技术的一些实施例中，所述衍生化反应包括如下步骤：使用20μl166.67mg/ml2-ab溶液与富集的唾液酸化寡糖在65℃下反应4小时。由于dmso溶剂效应导致色谱峰峰形异常，将加入的衍生试剂体积等比例缩小至6μl，峰形较好。

48、本发明中，液质联用检测中的流动相流速较佳地为0.3～0.6ml/min，例如为0.56ml/min。

49、本发明中，所述洗脱梯度中，所述“78％-45％”可按照本领域常规理解为在该时间段内d相在流动相的体积占比从78％逐渐降至45％。以此类推。

50、本发明中，较佳地，所述液相色谱质谱联用检测中所采用的色谱柱为glycan behamide column(2.1×100mm，granulation of 1.7μm，waters)。

51、本发明中，液质联用检测中色谱分析的运行时间可以为20～40分钟，也可以为25～35分钟，较佳地，色谱分析的参数运行时间为30分钟。

52、本发明中，液质联用检测中的进样量可以为40～60μl，也可以为45～55μl，较佳地，色谱分析的进样量为50μl。

53、本发明中，液质联用检测中的进样盘温度可以为10℃以下，较佳地，进样盘温度为4℃。

54、本发明中，液质联用检测中的流动相水相的起始比例不高于25％，较佳地，水相的起始比例为22％。

55、本发明中，液质联用检测后，还可包括使用软件xcalibur和glycoworkbench对寡糖结构进行定性分析。

56、本发明的积极进步效果在于：

57、1)与其他材料相比，本发明的富集方法采用的材料制备简单，反应条件温和，材料制备所需原料成本低且易得。且该材料能够有效从样本中富集唾液酸化寡糖，具有良好的富集效率。

58、2)本发明的检测方法灵敏度高，检测限低，抗干扰能力强。利用高分辨质谱进行唾液酸寡糖的定性分析，具有高分辨率，能够鉴别分子量相差0.01da的两种糖链。