检测甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的试剂套装

本发明属于分析检测，涉及一种检测甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的试剂套装，具体涉及一种检测甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的试剂套装、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、叶酸又称蝶酰谷氨酸，是重要的外源性b族维生素。人体吸收的叶酸在肝内转化为四氢叶酸和其他还原型衍生物。其中，5-甲基四氢叶酸是最主要的活性代谢物，约占血浆中叶酸含量的98％，其主要的生物学功能是作为体内生化反应中的一碳单位载体，参与dna、rna的合成以及氨基酸的代谢。

2、甲氨蝶呤是一种与叶酸结构相似的抗肿瘤药物，通过干扰叶酸代谢，抑制肿瘤细胞增殖，在提高疾病缓解率和延长生存期方面具有重要作用。目前，大剂量甲氨蝶呤治疗策略广泛应用于急性淋巴细胞白血病、骨肉瘤和非霍奇金淋巴瘤等疾病的治疗。然而，甲氨蝶呤作用于肿瘤细胞的同时也会影响正常细胞代谢，造成骨髓抑制、肝肾功能损伤、消化道反应、黏膜损害以及神经系统损伤等毒副作用。临床上，通常使用5-甲酰四氢叶酸钙(人体内以5-甲酰四氢叶酸形式存在)进行毒副作用解救。5-甲酰四氢叶酸钙为5-甲酰四氢叶酸的钙盐，作为大剂量甲氨蝶呤的解毒剂被补充入体内时，可越过叶酸转变为四氢叶酸的过程，直接转变为5-甲基四氢叶酸发挥生理学效应，因而不受大剂量甲氨蝶呤的干扰。

3、在使用甲酰四氢叶酸钙解救甲氨蝶呤毒副作用过程中，解救次数因患者而异。例如，对于急性淋巴细胞白血病患儿，多数患儿在解救1～5次后甲氨蝶呤血药浓度降至安全范围，少数患儿则需经历30余次解救，甲氨蝶呤血药浓度才能降至可接受范围。因此，采用大剂量甲氨蝶呤治疗/5-甲酰四氢叶酸钙解救策略时，测定用药前和用药后的甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸钙及5-甲基四氢叶酸的水平，对于急性淋巴细胞白血病、骨肉瘤和非霍奇金淋巴瘤的治疗具有重要意义。

4、现阶段检测人体叶酸及其代谢物的方法包括放射免疫分析法、化学发光分析法、微生物法、气相色谱-串联质谱法等，上述方法普遍存在灵敏度低、稳定性差等局限。超高效液相色谱-串联质谱是将超高效液相色谱与质谱分析技术相结合的检测方法，可以同时呈现各组分的分子量和结构信息，提高了临床检测的灵敏度和准确性。

5、专利cn 112083108 b公开了一种利用高效液相色谱-串联质谱联用技术定量检测人体内叶酸及其主要代谢产物(5-甲基四氢叶酸和5-甲酰四氢叶酸)的方法。专利cn112834677 a公开了一种液相色谱-串联质谱联用技术同时检测同型半胱氨酸及代谢相关物质(甲硫氨酸、吡哆醇、叶酸和5-甲基四氢叶酸)的方法。此外，专利cn 105181829 b公开了一种超高效液相色谱-串联质谱联用技术同步检测植物叶片总叶酸及叶酸衍生物(四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、10-甲酰叶酸、10-甲酰四氢叶酸)含量的方法。专利cn110146626a公开了一种高效液相色谱-串联质谱联用技术测定血斑中叶酸和5-甲基四氢叶酸含量的方法。专利cn 11309033 a公开了一种高效液相色谱-串联质谱联用技术测定人体内叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、s-腺苷甲硫氨酸、s-腺苷同型半胱氨酸和同型半胱氨酸含量的方法。上述方法能够对叶酸及其代谢物进行测定，但未能对与叶酸结构相似的治疗药物甲氨蝶呤进行联合检测。因而，现有技术无法解决急性淋巴细胞白血病、骨肉瘤和非霍奇金淋巴瘤等疾病治疗过程中治疗药物、解救药物及相关物质的体内水平的同时监测。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术不足和临床治疗重大需求提供一种检测甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的试剂套装和试剂盒，利用该试剂套装或试剂盒能够同时定量检测检测甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸。

2、本发明还提供了上述试剂套装在制造所述试剂盒中的应用，利用该试剂盒能够准确掌握治疗药物、解救药物及相关物质的体内水平。

3、为此，本发明第一方面提供了一种检测甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的试剂套装，其能够同时定量检测甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸，其由固相萃取板、标准溶液、内标溶液、活化溶液、溶液a、溶液b和质控样本组成。

4、本发明中，所述固相萃取板为混合阴离子型固相萃取板，其能够特异性结合酸性化合物。

5、根据本发明，所述溶液a由溶剂a与抗氧化剂配制而成；其中，溶剂a为99.9％纯水+0.1％氨水，所述抗氧化剂为抗坏血酸、柠檬酸、2-巯基乙醇和二硫苏糖醇；在所述溶液a中，所述抗坏血酸、柠檬酸、2-巯基乙醇和二硫苏糖醇浓度分别独立地为20-100μg/ml。

6、在本发明的一些实施例中，所述标准溶液为用溶液a配制的甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的标准品溶液，其中，甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸标准品的浓度范围为0.1ng/ml～5000ng/ml。

7、在本发明的另一些实施例中，所述内标溶液为用溶液a配制的甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的同位素标准品溶液，其中，甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸同位素标准品的浓度范围为0.1ng/ml～500ng/ml。

8、根据本发明，所述溶液b由溶剂b与抗氧化剂配制而成；其中，溶剂b为98％甲醇+2％甲酸，所述抗氧化剂为抗坏血酸、柠檬酸、2-巯基乙醇和二硫苏糖醇；在所述溶液b中，所述抗坏血酸、柠檬酸、2-巯基乙醇和二硫苏糖醇浓度分别独立地为20-100μg/ml。

9、本发明中，采用含抗坏血酸、柠檬酸、2-巯基乙醇和二硫苏糖醇的氧化剂的混合液作为叶酸代谢物的保护剂，增加了叶酸代谢物的稳定性，提高了叶酸代谢物定量检测的可靠度。

10、在本发明的一些实施例中，所述活化溶液为甲醇；和/或，所述质控样本为含有甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的血清样本，共有低浓度、中浓度和高浓度3份样本。

11、本领域技术人员应该了解的是，用作质控样本的血清样本中的甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的低浓度、中浓度和高浓度范围并不完全相同。

12、例如，在一些例子中，用作质控样本的血清样本中所含叶酸的的低浓度为5ng/ml、中浓度为20ng/ml、高浓度为100ng/ml。

13、在另一些例子中，用作质控样本的血清样本中所含5甲基四氢叶酸、5甲酰四氢叶酸和甲氨喋呤的低、中浓度分别独立地为50、200和1000ng/ml。

14、本发明第二方面提供了一种检测甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的试剂盒，其含有如本发明第一方面所述的试剂套装。

15、本发明第三方面提供了一种如本发明第一方面所述的试剂套装在制备检测人体内甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的试剂盒中的应用，其包括：

16、步骤l，将待测样本或标准溶液与内标溶液和溶液a混合均匀，获得第ⅰ混合液；

17、步骤m，用活化溶液和溶液a依次对固相萃取板进行活化、平衡处理；加入步骤l的第ⅰ混合液进行上样；用溶液a洗涤固相萃取板；用溶液b洗脱得到目标组分溶液；氮吹至干燥；加入溶液a复溶，得到待测溶液；

18、步骤n，采用超高效液相色谱-串联质谱联用技术测定步骤m得到的待测溶液，采用内标外标曲线法，计算样品溶液中甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的含量。

19、在本发明的一些实施例中，步骤m中的超高效液相色谱条件如下：色谱柱：hss t32.1(内径)×100mm(长度)，粒径1.8μm；柱温：40℃；流动相a为水+0.1％甲酸；流动相b为乙腈；梯度洗脱：0～0.5min，a 92％～92％；0.5～2.5min，a 92％～75％；2.5～2.6min，a75％～5％；2.6～3.0min，a 5％～5％；3.0～4.0min，a 5％～92％；

20、和/或，步骤m中的质谱条件如下：离子化模式：esi+，多反应监测模式。毛细管电压：1kv，锥孔电压：50v，锥孔气流速：50l/hr，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂流速：1000l/hr(小时)。

21、目标物质的检测参数如下：

22、表1.目标物质检测参数表

23、

24、本发明中上述应用可以理解为利用本发明所提供的试剂套装或试剂盒同检测甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的方法。

25、本发明中所述用语“日内精密度”是指在同一天内不同时间对同一被测物进行次平行测定时，各个结果间的接近程度。

26、本发明中所述用语“日间精密度”是指在不同天内对同一被测物进行重复测量所得结果间的一致程度。

27、本发明提供了一种同时检测甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的试剂套装和试剂盒。本发明还提供了利用该试剂套装或试剂盒同时检测甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的方法。与背景技术部分的现有技术方案相比，该方法通过特异性固相萃取板，对血液中的上述物质进行有效富集；同时，用含抗坏血酸、柠檬酸、2-巯基乙醇和二硫苏糖醇的混合液作为叶酸代谢物的保护剂，增加了叶酸代谢物的稳定性，提高了叶酸代谢物定量检测的精确度和可靠度；从而实现了甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的高效、稳定、精准检测。本方法具有线性范围宽、精密度高、重现性好、操作简便、易于推广等优点，对于推动急性淋巴细胞白血病、骨肉瘤和非霍奇金淋巴瘤治疗过程中药物监测技术的更新与升级以及患者的治疗安全具有重要意义。