一种鉴别中成药中柴胡的薄层色谱方法及其应用与流程

本发明涉及中药检测，特别是涉及一种鉴别中成药中柴胡的薄层色谱方法及应用。

背景技术：

1、柴胡为《中国药典》收录的中药，药用部位为伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根。春、秋二季采挖，除去茎叶及泥沙，干燥。柴胡是常用解表药，别名地熏、山菜、菇草、柴草，性味苦、微寒，归肝、胆经。有和解表里，疏肝升阳之功效。用于感冒发热、寒热往来、疟疾、肝郁气滞、胸肋胀痛、脱肛、子宫脱垂、月经不调等。

2、柴胡作为一种使用历史悠久的中药，被广泛应用于各种中成药中，如小柴胡颗粒、乳核散结片、感冒清热颗粒、小儿柴桂退热颗粒等。目前《中国药典》2020年版一部中含柴胡中成药薄层色谱鉴别项下，采用的薄层条件为：以硅胶板作为薄层板，以乙酸乙酯-乙醇-水(12∶2∶1)为展开剂展开，随后喷以1％对二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。

3、然而，上述薄层色谱鉴别存在难以将柴胡中含量较高皂苷类成分(柴胡皂苷a、d、b1和b2)分开的问题。

技术实现思路

1、基于此，有必要针对目前薄层色谱鉴别中难以将柴胡中皂苷类成分层析分开的问题，提供一种鉴别中成药中柴胡的薄层色谱方法，采用该方法的薄层色谱鉴别条件，能够将柴胡中四个皂苷类成分柴胡皂苷a、d、b1和b2完全分离。

2、一种鉴别中成药中柴胡的薄层色谱方法，包括以下步骤：

3、样品制备：分别取待检样品，以及柴胡皂苷对照品和/或柴胡对照药材，分别制成供试品溶液，以及对照品溶液和/或对照药材溶液；

4、薄层色谱鉴别：取上述样品溶液，分别点样于硅胶薄层板上，先用体积比为4∶1的三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，再以体积比为5∶65∶10∶8∶8的三氯甲烷-乙酸乙酯-丙酮-无水甲酸-水为展开剂展开，显色，即得。

5、上述鉴别中成药中柴胡的薄层色谱方法，通过二次展开的方式，使柴胡中四个皂苷类成分柴胡皂苷a、d、b1和b2可以达到完全分离的效果，能够对含有柴胡的中成药进行准确的鉴别。

6、可以理解的，上述二次展开的方式，第一次展开后需要将溶剂完全晾干，再进行第二次的展开，第二次展开以常规薄层色谱展开方式即可，以溶剂前沿展开至薄层板顶端附近即可。

7、在其中一个实施例中，所述柴胡皂苷对照品选自：柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷b1和柴胡皂苷b2中的至少一种。

8、可以理解的，上述柴胡皂苷对照品的使用，在方法建立初期使用，当方法建立，获得对照品在薄层板上相应位置后，在后续实验中可不再每次均使用对照品进行定位。

9、在其中一个实施例中，所述薄层色谱鉴别步骤中，所述显色条件为：喷以1％对二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视。可以理解的，上述1％对二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液为100ml10％硫酸乙醇溶液中含有1g对二甲氨基苯甲醛，其浓度单位为质量体积百分浓度，上述10％硫酸乙醇溶液为将取10ml浓硫酸溶液，加入乙醇至100ml即可配制得到，为本领域常用显色剂。

10、在其中一个实施例中，所述样品制备步骤中，供试品溶液制备方法如下：

11、甲醇法：取供试品，加入甲醇作为溶剂超声提取，过滤，取滤液蒸干，残渣加水饱和正丁醇溶解，用氨试液洗涤，取水饱和正丁醇溶液，蒸干，残渣加甲醇，即得；

12、或者

13、水煎煮法：取供试品，加入水作为溶剂进行回流，过滤，取滤液，加水饱和正丁醇萃取，取水饱和正丁醇层，用氨试液洗涤，取水饱和正丁醇溶液，蒸干，残渣加甲醇，即得供试品溶液；

14、或者

15、酸水煎煮法：取供试品，加入水作为溶剂，并同时加入乙酸，进行回流，过滤，取滤液蒸干，残渣加水饱和正丁醇溶解，用氨试液洗涤，取水饱和正丁醇溶液，蒸干，残渣加甲醇，即得供试品溶液；

16、对照药材溶液制备方法如下：

17、水煎煮法：取柴胡对照药材，加入水作为溶剂进行煎煮，过滤，取滤液，加水饱和正丁醇萃取，取水饱和正丁醇层，用氨试液洗涤，取水饱和正丁醇溶液，蒸干，残渣加甲醇，即得对照药材溶液；

18、或者

19、酸水煎煮法：取柴胡对照药材，加入水作为溶剂，并同时加入乙酸，进行煎煮，过滤，取滤液蒸干，残渣加水饱和正丁醇溶解，用氨试液洗涤，取水饱和正丁醇溶液，蒸干，残渣加甲醇，即得对照药材溶液。

20、在其中一个实施例中，所述样品制备步骤中，供试品溶液制备方法如下：

21、甲醇法：取预定量供试品，加入甲醇50±10ml作为溶剂超声提取30±10min，过滤，取滤液蒸干，残渣加水饱和正丁醇50±10ml溶解，用氨试液洗涤，2±1次，每次20±5ml，取水饱和正丁醇溶液，蒸干，残渣加甲醇1±0.5ml，即得供试品溶液；

22、或者

23、水煎煮法：取预定量供试品，加入水50±10ml作为溶剂，回流30±10min，过滤，取滤液加水饱和正丁醇萃取，每次30±10ml，合并水饱和正丁醇层，用氨试液洗涤，2±1次，每次20±5ml，取水饱和正丁醇溶液，蒸干，残渣加甲醇1±0.5ml，即得供试品溶液；

24、或者

25、酸水煎煮法：取预定量供试品，加入水50±10ml作为溶剂，并同时加入乙酸0.25-2ml，回流煮30±10min，过滤，取滤液加水饱和正丁醇萃取，每次30±10ml，合并水饱和正丁醇层，用氨试液洗涤，2±1次，每次20±5ml，取水饱和正丁醇溶液，蒸干，残渣加甲醇1±0.5ml，即得供试品溶液；

26、对照药材溶液制备方法：

27、水煎煮法：取柴胡对照药材0.5g，加入水50±10ml作为溶剂，煎煮30±10min，过滤，取滤液加水饱和正丁醇萃取，每次30±10ml，合并水饱和正丁醇层，用氨试液洗涤，2±1次，每次20±5ml，取水饱和正丁醇溶液，蒸干，残渣加甲醇1±0.5ml，即得对照药材溶液；

28、或者

29、酸水煎煮法：取柴胡对照药材0.5g，加入水50±10ml作为溶剂，并同时加入乙酸0.25-2ml，进行煎煮30±10min，过滤，取滤液加水饱和正丁醇萃取，每次30±10ml，合并水饱和正丁醇层，用氨试液洗涤，2±1次，每次20±5ml，取水饱和正丁醇溶液，蒸干，残渣加甲醇1±0.5ml，即得对照药材溶液。

30、可以理解的，上述供试品的使用量，根据具体所用供试品的品种，按照药典要求取样。

31、在其中一个实施例中，在所述样品制备步骤前，还包括预实验步骤，所述预实验步骤如下：

32、取待检样品，按照以下方法制备得到供试品预实验溶液，

33、供试品预实验溶液按照药典中供试品溶液制备方法得到；

34、再按照所述薄层色谱鉴别步骤进行鉴别，观察斑点情况，如各批次供试品预实验溶液中，部分批次在皂苷a和b2位置呈现相同颜色的荧光斑点，部分批次在皂苷b1和b2位置呈现相同颜色的荧光斑点，则在所述样品制备步骤中，供试品溶液和对照药材溶液均采用酸水煎煮法制备，如各批次供试品预实验溶液均在皂苷b1和b2位置呈现相同颜色的荧光斑点，则在所述样品制备步骤中，供试品溶液采用甲醇法制备，对照药材溶液采用酸水煎煮法制备。

35、可以理解的，上述药典方法指《中国药典》2020版中对含柴胡中成药薄层色谱鉴别的供试品溶液制备方法。如供试品为小柴胡颗粒，则供试品溶液制备方法为：取小柴胡颗粒样品5g〔规格(1)〕、2g〔规格(2)〕或1.25g〔规格(3)〕，即根据不同规格，分别取样半袋，加水50ml，加热回流30分钟，放冷，过滤，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并水饱和正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次20ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品预实验溶液。

36、如供试品为乳核散结片，则供试品溶液制备方法为：取本品30片，糖衣片除去包衣，研细，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水饱和正丁醇50ml使溶解，用氨试液洗涤两次，每次20ml，取正丁醇液蒸干,残渣加甲醇1ml使其溶解，作为预实验供试品溶液。

37、本发明人在前期实验中发现，含柴胡中成药供试品斑点常与柴胡对照药材(按照常规水煎煮方式提取)斑点对应性较差，尤其小柴胡颗粒不同企业特征性斑点差别较大，而柴胡对照药材按处方工艺(水煎煮)制备得对照药材图谱与柴胡皂苷a和b2对照品斑点一致，未能观察到柴胡皂苷b1斑点，上述情况容易造成检验人员对结果判断的困惑和疑问。经过反复试验和摸索后发明人发现，由于中成药在制备过程中各药味共煎、成分之间的相互作用，可能导致了柴胡皂苷a和d转化成柴胡皂苷b1和b2。

38、在此基础上，发明人尝试通过调整供试品和对照药材的前处理方法，以得到具有较好可比性的统一的柴胡皂苷斑点，并通过预实验的进行，预判供试品成分的组成，从而选用不同的前处理方法，以获得能够准确反映供试品情况且易于检验人员判断的鉴别结果。

39、在其中一个实施例中，所述酸水煎煮法中，加入乙酸使供试品溶液、对照药材溶液ph值与预实验步骤中，各批次供试品预实验溶液的ph值最低者相同。例如，当供试品为小柴胡颗粒，加入乙酸使供试品溶液、对照药材溶液至ph为3-4；当供试品为小柴胡颗粒，乳核散结片加入乙酸使供试品溶液、对照药材溶液至ph为5。

40、本发明还公开了上述的薄层色谱方法在鉴别含有柴胡的中成药中的应用。

41、在其中一个实施例中，所述中成药包括：小柴胡颗粒、乳核散结片、感冒清热颗粒、小儿柴桂退热颗粒。

42、本发明通过实验筛选调整，构建了一种薄层色谱方法鉴别中成药中柴胡的薄层色谱方法，并已经成功应用于小柴胡颗粒、乳核散结片、小儿柴桂退热颗粒中。

43、在其中一个实施例中，所述中成药为小柴胡颗粒，以酸水煎煮法制备供试品溶液和对照药材溶液；所述中成药为乳核散结片，以甲醇法制备供试品溶液，以酸水煎煮法制备对照药材溶液。本发明人通过实验发现，不同企业小柴胡颗粒薄层色谱斑点一致性较差；乳核散结片薄层色谱斑点与柴胡对照药材图谱一致性较差，通过上述处理方法能够提高结果的一致性。

44、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

45、本发明的一种鉴别中成药中柴胡的薄层色谱方法，以薄层色谱二次展开的方式，使柴胡中四个皂苷类成分柴胡皂苷a、d、b1和b2可以达到良好的分离效果，能够对含有柴胡的中成药进行准确的鉴别。

46、并且，还通过实验发现常规含柴胡制剂(柴胡水提取工艺)柴胡薄层鉴别中供试品与对照物质对应性差的问题，是由于中成药在制备过程中各药味共煎、成分之间的相互作用而使成分变化导致，从而通过调整供试品和对照药材的前处理方法，以得到斑点对应性良好、具有较好可比性的柴胡皂苷斑点，并利用预实验的结果，预判供试品成分的组成，从而选用不同的前处理方法，以获得能够准确反映供试品情况且易于检验人员判断的鉴别结果。

47、同时解决了部分中成药由于不同企业的生产环境有差异导致的不同企业的同一中成药品种柴胡药味薄层色谱行为不完全一致的问题。

48、且在方法建立之后，后续的鉴别过程中，仅使用柴胡对照药材即可达到鉴别目的，无需额外制备及使用柴胡皂苷b1和柴胡皂苷b2对照品，既丰富了鉴别的信息量，又减少了对照品的使用，对照物质经济易得，方法绿色环保。