一种混合模式固相萃取-HPLC-MS/MS测定畜禽肉及水产品中代谢调节剂曲美他嗪的方法与流程

本发明涉及食品畜禽肉与水产品检测领域，具体涉及一种混合模式固相萃取-hplc-ms/ms测定畜禽肉及水产品中代谢调节剂曲美他嗪的方法。

背景技术：

1、曲美他嗪是一种临床用于治疗冠脉功能不全、心绞痛、陈旧性心肌梗塞等疾病的药物，能促进心肌代谢及心肌能量的产生，降低心肌耗氧量及心肌能量的消耗，从而改善心肌氧的供需平衡。具有提高运动员心肌细胞能量储备，改善心脏功能，提高运动耐力的作用。2021年，世界反兴奋剂机构发布的《世界反兴奋剂条例国际标准禁用清单》中明确规定曲美他嗪为激素及代谢调节剂类禁用物质。激素及代谢调节剂，调节各组织细胞的代谢活动来影响人体生理活动，包括机体的代谢、生长、发育、繁殖和性活动等；具有舒张气道、提高肌肉力量、兴奋呼吸系统和神经系统的作用。我国体育总局反兴奋剂中心也在2021年11月《大型赛事食源性兴奋剂防控工作指南》中将曲美他嗪作为代谢调节剂列入建议检测药物名单，并规定其参考检出限为2.0μg/kg。近年来,食品中被检测出兴奋剂阳性的事件屡见不鲜，运动员在误服误用被兴奋剂污染的食品后，会导致兴奋剂检测呈阳性，对运动员和国家都具有重大损失。因此，为了避免大型赛事期间运动员发生食源性兴奋剂事件，建立食品中的曲美他嗪分析检测方法具有重要意义。

2、目前，国内目前尚未制定食品中曲美他嗪的相关检测标准，关于曲美他嗪的检测技术报道也较少。前处理净化方法主要有液-液萃取法、蛋白质沉淀方法、固相萃取。液-液萃取法与蛋白质沉淀方法操作简单，但净化效果差、基质效应严重，常规的固相萃取吸附材料只能去除部分脂肪，不能有效去除磷脂。检测方法主要有薄层色谱法、分光光度法、气相色谱法、液相色谱法、液液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-四极杆-静电场离子轨道阱高分辨质谱。其中高分辨质谱，价格昂贵，多用于筛查与确证；气相色谱法大多需要衍生，且分析时间较长；其他方法均存在定性不准确，灵敏度偏低难以满足痕量残留的检测要求；液相色谱-串联质谱法定性与定量准确、灵敏度高、抗干扰能力强，更适合于复杂基质中痕量化合物的分析检测。曲美他嗪检测技术报道的基质主要是片剂以及生物样本血浆、尿液等基质，而畜禽肉与水产品中曲美他嗪分析测定的研究尚未见报道。对于动物组织样品，基质更为复杂，需要更为有效的提取净化方法，以实现更加可靠有效的食源性兴奋剂污染控制。

3、本发明针对畜禽肉与水产品中曲美他嗪无检测标准，无法满足监管需求的问题，采用混合模式固相萃取柱净化，以建立超高效液相色谱-串联质谱法测定畜禽肉及水产品中的代谢调节剂曲美他嗪的分析方法。为我国体育赛事食品安全保障工作和相关标准的制订提供了有效的技术支撑。

技术实现思路

1、本发明针对畜禽肉与水产品中曲美他嗪无检测标准，无法满足监管需求的问题，首次系统建立了混合模式固相萃取-hplc-ms/ms测定畜禽肉及水产品中代谢调节剂曲美他嗪的检测方法。本研究样品加入水充分分散后，采用酸化乙腈提取，通过混合模式固相萃取柱净化除去样品中的磷脂、蛋白、脂肪等干扰物，采用超高效液相色谱-串联质谱法进行测定，以内标法定量校正前处理过程中目标物的损失并降低基质效应的影响。方法灵敏度高、普适性强、稳定性强，能够满足于大型体育赛事中代谢调节剂曲美他嗪的监管要求。

2、本发明具体技术方案如下：

3、一种混合模式固相萃取-hplc-ms/ms测定畜禽肉及水产品中代谢调节剂曲美他嗪的方法，包括如下步骤：

4、(1)分别采用曲美他嗪、曲美他嗪-d8的标准溶液，用甲醇定容并稀释，分别配成曲美他嗪标准中间液、曲美他嗪-d8同位素内标中间液；

5、(2)分别取适量不同体积的曲美他嗪标准中间液，各加入适量相同体积曲美他嗪-d8同位素标准中间液，配制成系列浓度的标准工作溶液；

6、(3)称取试样于离心管中，加入曲美他嗪-d8内标中间液，加入2ml水，涡旋充分混匀；

7、(4)加入甲酸乙腈，涡旋混匀后超声，离心后取全部上清液，加入水，混匀后上样于固相萃取柱，再依次用水、甲醇淋洗，抽干，最后用氨水甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，得到残留物；

8、(5)加入甲酸-乙腈溶解残留物，经有机相滤膜过滤后，得到待测物，然后注入超高效液相色谱质谱联用仪中进行测定；

9、(6)将系列浓度的标准工作溶液按浓度由低到高依次经超高效液相色谱质谱联用仪分析测定，以曲美他嗪的质量浓度为横坐标，曲美他嗪峰面积与其内标面积之比为纵坐标，绘制标准曲线。

10、优选地，步骤(4)采用体积比为0.5％甲酸乙腈作为提取溶剂。

11、优选地，步骤(4)的固相萃取柱采用prime mcx柱。

12、优选地，步骤(4)采用体积比为3％氨水甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，40℃氮气吹干。

13、优选地，液相色谱条件为：

14、waters acquity uplc hss t3色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相a为0.1％甲酸溶液，b为乙腈；进样量2μl；柱温35℃；流速0.30ml/min；梯度洗脱程序：0～0.5min，98％a；0.5～2.0min，98％a～70％a；2.0～4.0min，70％a～5％a；4.0～6.0min，5％a；6.0～6.1min，5％a～98％a；6.1～7.0min，98％a。

15、优选地，质谱条件为：

16、喷射流电喷雾电离源，正离子模式；干燥气温度250℃；干燥气流量5l/min；雾化气压力45psi；鞘气温度350℃；鞘气流量，11l/min；毛细管电压4000v；喷嘴电压500v；采集模式多反应监测。

17、优选地，所述步骤(3)为：称取2g均匀的试样于50ml螺纹带盖的离心管中，加入20μl 1.00μg/ml曲美他嗪-d8内标中间液，加入2ml水，涡旋充分混匀；

18、步骤(4)：加入8ml 0.5％甲酸乙腈，涡旋混匀后超声25min，离心后取全部上清液，加入15ml水，混匀后上样于prime mcx固相萃取柱，再依次用6ml水、6ml甲醇淋洗，抽干，最后用2ml 3％氨水甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃氮气吹干；

19、步骤(5)加入体积比为9:1的0.1％甲酸-乙腈2.00ml溶解残留物，经0.22μm有机相滤膜过滤。

20、有益效果：

21、本方法以畜禽肉与水产品为研究对象，首次建立了代谢调节剂曲美他嗪的分析测定方法。本研究样品提取前先加入水充分分散，有效解决了畜禽肉与水产品基质遇甲醇或乙腈易凝结成团，不利于曲美他嗪提取的问题；采用0.5％甲酸乙腈提取，提高了提取效率；经混合模式prime mcx固相萃取柱净化，有效去除了蛋白、磷脂、脂肪的干扰，减少了基质效应；超高效液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量，提高了分析方法的准确性与稳定性。本方法灵敏度高、普适性强、稳定性强，能够满足于大型体育赛事中代谢调节剂曲美他嗪的监管要求。本方法适用于畜禽肉及水产品中食源性兴奋剂曲美他嗪的测定，填补了曲美他嗪相关检测方法的空白，为大型体育赛事的食品安全风险监测提供了技术支持。