一种双电位电化学发光免疫传感器及其应用

本发明属于化学检测，具体涉及一种双电位电化学发光免疫传感器及其应用。

背景技术：

1、氯霉素类抗生素(包括氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素)以抗菌谱广、机体易吸收、用药成本低等优点广泛应用于动物细菌病的防治。其中氯霉素(cap)是一种高效的广谱抗生素，对革兰氏阳性和阴性细菌有很强的抑制作用。由于其优良的抗菌性能、稳定的药效和低廉的价格，在畜牧业和水产养殖业中得到了广泛的应用。然而，氯霉素具有巨大的毒副作用，并且容易在动物和人体内富集，由此可能引起严重的不可逆的骨髓抑制反应，造成人体和动物发生再生障碍性贫血。为此，许多地方明文规定氯霉素禁止用于动物饲养和治疗。但是，由于利益的驱使，一些商家仍然将氯霉素用于畜牧业和水产养殖业中，严重危害人们的健康。

2、鉴于氯霉素被禁用，在八十年代后期生产出了以磺酸基替代氯霉素分子苯环上对位硝基的第二代氯霉素类抗生素－氟苯尼考(ff)，其对动物与人体的毒副作用大大地降低，它是动物专用抗菌药，用于敏感细菌所致的猪、鸡及鱼的细菌性疾病，尤其对呼吸系统感染和肠道感染疗效显著。尽管其毒副作用远远小于氯霉素，但是氟苯尼考有免疫抑制的作用，容易造成细胞的基因链重组，机体抵抗力下降，还具有胚胎毒性，不可用于妊娠期及哺乳期家畜。由于氟苯尼考与氯霉素同属于氯霉素类抗生素，两者关系密切，且两者之间不存在交叉反应，所以同时检测这两种抗生素具有重大意义。

3、电化学发光(ecl)其是化学发光和电化学的结合，因此综合了两者各方面的优势，具有仪器简单、背景信号低、线性工作范围宽等优点。电化学发光免疫分析法(eclia)是电化学发光和免疫分析法的有效结合，兼具两者的优点，具有操作简单、特异性好，灵敏度高等优点。然而，传统的电化学发光免疫传感方法通常只能检测一种目标物，当检测多个目标物时，需要准备多个传感器，这大大增加了检测成本。因此，关于同时测定多个组分的研究将成为未来的研究重点。因此，有必要开发一种同时检测氟苯尼考和氯霉素的电化学发光免疫传感方法，以降低操作难度、提高检测灵敏度。

技术实现思路

1、目前对食源性动物中同时检测氟苯尼考和氯霉素残留量的测定方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等。这些传统的检测方法大多具有成本较高、样品预处理步骤复杂、操作繁琐等局限性，因此探索和开发具有高灵敏度和高特异性的检测分析方法具有一定现实意义。

2、为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种双电位电化学发光免疫传感器及其在检测氟苯尼考和氯霉素中的应用，本发明开发了一种基于双电位电化学发光的竞争型ecl免疫传感器，使用au/nsg纳米复合材料修饰电极，ru@mof和sns2qds-pei-au-mos2作为两种电化学发光探针，用于超灵敏定量同时检测氟苯尼考和氯霉素。

3、本发明提供一种双电位电化学发光(ecl)免疫传感器，包括第一电化学发光探针、第二电化学发光探针和电化学发光电极；

4、两种电化学发光探针，其包括ru@mof，所述ru@mof通过化学键连接有氟苯尼考抗体；其包括sns2 qds-pei-au-mos2，所述sns2 qds-pei-au-mos2通过化学键连接氯霉素抗体；

5、电化学发光电极，其包括电极本体，所述电极本体上修饰有au/nsg纳米复合材料，所述au/nsg纳米复合材料通过化学键连接有氟苯尼考包被抗原和氯霉素包被抗原。

6、所述第一电化学发光探针由以下步骤制备得到：

7、s11：将聚乙烯吡咯烷酮、硝酸锌、三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌和2-氨基对苯二甲酸进行加热反应，得到ru@mof；

8、s12：将ru@mof用交联剂活化后，加入氟苯尼考抗体(ff-ab)孵育，得到所述第一电化学发光探针；

9、所述第二电化学发光探针由以下步骤制备得到：

10、s21：分别制备sns2 qds和mos2 nf；所述sns2 qds由氯化锡和l-半胱氨酸通过加热反应得到，所述mos2nf由钼酸钠与硫脲通过高温反应制备得到；

11、s22：将sns2 qds用交联剂活化后，加入聚乙烯亚胺(pei)进行一次反应，得到偶联反应物；

12、s23：将所述偶联反应物和au-mos2进行二次反应，得到sns2 qds-pei-au-mos2；所述au-mos2由所述mos2nf、pvp、氯金酸和抗坏血酸通过加热反应得到；

13、s24：将所述sns2 qds-pei-au-mos2和氯霉素抗体(cap-ab)孵育，得到第二电化学发光探针；

14、所述电化学发光电极由以下步骤制备得到：

15、s31：将氧化石墨烯、l-半胱氨酸和氯金酸混合后加热反应，得到au/nsg；

16、s32：将所述au/nsg修饰于电极上，加入氟苯尼考包被抗原(ff)和氯霉素包被抗原(cap)，孵育，得到所述电化学发光电极。

17、优选的，所述步骤s11和s12中，加热反应的温度为90-110℃。

18、具体的，所述步骤s11中，溶液a和溶液b混合后加热反应，得到中间产物；所述溶液a由聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶于醇和有机溶剂中得到；所述溶液b由硝酸锌、三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌(ru(dcbpy)32+，cas：97333-46-5)和2-氨基对苯二甲酸溶于有机溶剂中得到；向所述中间产物中加入dmf后加热反应，得到ru@mof；

19、进一步地，所述醇为乙醇，有机溶剂为dmf(n,n-二甲基甲酰胺)。

20、进一步地，所述溶液a和溶液b的加热反应的时间为4-6h。

21、进一步地，所述所述中间产物的加热反应的时间为7-9h。

22、优选的，所述步骤s12和s22中，交联剂均为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)。

23、优选的，所述步骤s12中，ru@mof和氟苯尼考抗体的质量比为300-500:1。

24、优选的，所述步骤s12、s24和s32中，孵育后加入牛血清白蛋白(bsa)进行封阻。

25、进一步地，所述封阻的温度为3-5℃，时间为0.5-1.5h。

26、优选的，所述步骤s21中，加热反应的温度为160-200℃，时间为5-7h。

27、优选的，所述步骤s21中，高温反应的温度为180-220℃，时间为22-26h。

28、优选的，所述步骤s22中，活化的温度为室温，时间为1-3h。

29、优选的，所述步骤s22中，一次反应的时间为1-3h。

30、优选的，所述步骤s23中，二次反应的时间为1-3h。

31、优选的，所述步骤s23中，加热反应的温度为50-70℃，时间为10-30min。

32、优选的，所述步骤s24中，sns2 qds-pei-au-mos2和氯霉素抗体的体积比为1:5。

33、优选的，所述bsa的浓度为wt.5％。

34、优选的，所述步骤s32中，电极为玻碳电极(gce)。

35、优选的，所述步骤s32中，au/nsg、氟苯尼考包被抗原和氯霉素包被抗原的质量比为250:4-6:1-3。

36、进一步地，所述步骤s32中，将au/nsg直接滴加在经过抛光的电极本体表面，干燥后再向电极本体表面滴加氟苯尼考包被抗原与氯霉素包被抗原。

37、优选的，所述步骤s12、s24和s32中，孵育的温度均为3-5℃，孵育的时间均为10-14h。

38、优选的，所述电化学发光探针的ru@mof溶液在离心前的浓度为2mg ml-1，sns2qds、pei、au-mos2的体积比为2:1:1，离心前的电化学发光探针的ru@mof溶液与氟苯尼考标准溶液的体积比为1:1，离心前的电化学发光探针的sns2 qds-pei-au-mos2溶液与氯霉素标准溶液的体积比为1:1。

39、具体的，所述第一电化学发光探针和第二电化学发光探针的制备方法包括以下步骤：

40、(1)将pvp溶解在乙醇和dmf的混合溶液中，得到溶液a，将zn(no3)2·6h2o、ru(dcbpy)32+(三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌cas：97333-46-5)与2-氨基对苯二甲酸溶解在dmf中，得到溶液b；

41、(2)将溶液b加入到溶液a中，超声混匀后在100℃下反应5h，再加入dmf，100℃下反应8h，将沉淀物离心并洗涤三次，真空干燥后得到ru@mof；

42、(3)用交联剂活化ru@mof中的羧基，然后将活化后的ru@mof与氟苯尼考抗体孵育，使所述氟苯尼考抗体通过酰胺键与活化后的ru@mof连接，得到所述第一电化学发光探针。

43、(4)将sncl4·5h2o与l-半胱氨酸溶解在超纯水中，并在180℃下反应6h，得到sns2qds；

44、(5)将钼酸钠与硫脲溶解在超纯水中，混匀后在200℃下反应24h，将沉淀物离心并洗涤三次，真空干燥后得到mos2nf，将mos2nf重新分散到超纯水中，加入pvp和氯金酸，混匀后再加入抗坏血酸溶液，60℃下反应20min，将沉淀物离心并洗涤三次得到au-mos2；

45、(6)用交联剂活化sns2 qds中的羧基，然后添加pei溶液，通过酰胺反应将两者偶联，再加入au-mos2，通过au-n键形成sns2 qds-pei-au-mos2，再将sns2 qds-pei-au-mos2与氯霉素抗体孵育，使所述氯霉素抗体通过au-n键与sns2 qds-pei-au-mos2连接，得到所述第二电化学发光探针。

46、进一步地，所述步骤(1)和(5)中，pvp的分子量为k30。

47、进一步地，所述ru@mof和氟苯尼考抗体的质量比为400:1，sns2 qds-pei-au-mos2和氯霉素抗体的体积比为1:5

48、具体的，所述电化学发光电极的制备方法，包括以下步骤：

49、(s1)将氧化石墨烯分散液与l-半胱氨酸混匀后加入氯金酸，超声后缓慢升温至80℃，

50、搅拌90min，将沉淀物离心并洗涤三次，真空冷冻干燥得到au/nsg；

51、(s2)将得到的au/nsg重新分散到超纯水中，再修饰到电极本体上，然后将电极本体在氟苯尼考包被抗原与氯霉素抗原中孵育，使所述氟苯尼考包被抗原与氯霉素抗原通过au-n键与au/nsg连接，得到所述电化学发光电极。

52、进一步地，所述步骤(s2)中，孵育温度为4℃。

53、进一步地，所述电化学发光电极中，au/nsg纳米复合材料与氟苯尼考包被抗原的质量比为50:1，au/nsg纳米复合材料与氯霉素包被抗原的质量比为125:1。

54、本发明制备的两种电化学发光探针和纳米复合材料修饰的电化学发光电极，由此构建的双电位电化学发光免疫传感器较传统的电化学发光免疫传感器具有可以同时检测两种目标物的优点，较传统的elisa法具有更高的灵敏度(15倍以上)。

55、本发明还提供上述双电位电化学发光免疫传感器在检测氟苯尼考和氯霉素中的应用，包括如下步骤：

56、s41：将第一电化学发光探针、第二电化学发光探针和不同浓度的氟苯尼考和氯霉素标准溶液混合后加入电化学发光电极，孵育，得到处理后的电化学发光电极；

57、s42：将所述处理后的电化学发光电极作为工作电极，利用三电极体系进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线，建立ecl发光强度与氟苯尼考和氯霉素浓度的关系，得到线性回归方程；

58、s43：重新取第一电化学发光探针、第二电化学发光探针和电化学发光电极加入待测溶液中，孵育后电化学发光电极作为工作电极，利用三电极体系中进行循环伏安扫描，根据测得电位-发光强度关系，结合所述线性回归方程得出所述待测溶液中氟苯尼考与氯霉素的浓度。

59、优选的，所述步骤s41中，所述氟苯尼考和氯霉素标准溶液的浓度均为0.01-1000ng ml-1。

60、优选的，所述步骤s43中，所述待测溶液的溶剂为乙酸乙酯。

61、具体的，所述双电位电化学发光免疫传感器在检测氟苯尼考和氯霉素中的应用，包括如下步骤：

62、(a1)将所述两种电化学发光探针的溶液分别离心去掉上清液，再将两种沉淀物与不同浓度的氟苯尼考和氯霉素标准溶液混合均匀，所述氟苯尼考标准溶液的浓度为0.1-1000ng ml-1，所述氯霉素标准溶液的浓度为0.01-1000ng ml-1，将得到的混合溶液与所述电化学发光电极共同孵育，孵育完全后，用缓冲液清洗未与电化学发光电极结合的电化学发光探针及氟苯尼考和氯霉素；

63、(a2)以经步骤(a1)处理后的电化学发光电极作为工作电极，利用三电极体系中进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线，建立ecl发光强度与氟苯尼考浓度、氯霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的两种线性回归方程；

64、(a3)向待测溶液中加入电化学发光探针，将得到的混合溶液与电化学发光电极共同孵育，孵育完全后，用缓冲液清洗电化学发光电极；

65、(a4)以经步骤(a3)处理后的电化学发光电极作为工作电极，利用三电极体系中进行循环伏安扫描，根据测得电位-发光强度关系，结合步骤(a2)建立的ecl发光强度与氟苯尼考、氯霉素浓度对数值的线性关系和线性回归方程得出待测溶液中氟苯尼考与氯霉素的浓度。

66、进一步地，所述步骤(a2)中，在-1.6～2v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压650v，放大级数为4，扫速0.5v/s，进行循环伏安扫描，ecl信号将随着氟苯尼考标准溶液浓度和氯霉素标准溶液的改变而改变。

67、进一步地，所述步骤(a2)和(a4)中，化学发光免疫传感器的电化学发光电极中，用au纳米颗粒在氮、硫杂化的氧化石墨烯上原位生长得到au/nsg纳米复合材料，不仅提高了电子转移效率，还为固定抗原提供了更大的表面积，经过au-n键与氟苯尼考包被抗原(ff-ag)与氯霉素抗原(cap-ag)结合。通过酰胺键将氟苯尼考抗体(ff-ab)与ru@mof探针相连，通过au-n键将氯霉素抗体(cap-ab)与sns2 qds-pei-au-mos2探针相连。

68、利用上述双电位电化学发光免疫传感器同时检测氟苯尼考和氯霉素时，定量基础是氟苯尼考与ff-ag竞争有限的ff-ab，氯霉素与cap-ag竞争有限的cap-ab。

69、本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：

70、本发明的目的在于针对同时检测氟苯尼考和氯霉素现有检测方法的不足，拟构建一种基于ru@mof和sns2 qds-pei-au-mos2这两种电化学发光探针的ecl免疫传感方法，能够应用于同时检测食品中氟苯尼考和氯霉素的残留。该免疫传感方法相比目前已出现的氟苯尼考或者氯霉素检测方法而言，可以同时检测这两种检测物的含量，并且其在时间、空间和发光强度方面的可控性强，同时它还具有操作简单、成本效益、灵敏度高、背景信号低、试剂消耗量少的优点。

71、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。