一种血糖检测电极、核酸检测电极及制备方法与流程

本发明涉及生物传感器，尤其涉及一种血糖检测电极、核酸检测电极及制备方法。

背景技术：

1、平面石墨烯是一种具有极佳导电性的材料，在多个领域中都有应用。在生物传感器技术领域，平面石墨烯被用作为生物传感器的电极载体进行广泛研究。但平面石墨烯作为电极载体是需要与结合物(如葡糖糖氧化酶、核酸)进行固定，从而能够让结合物与被测物进行结合，产生电信号，从而检测；若结合物没有固定在平面石墨烯上，在检测过程中，结合物会流失，导致检测失败。为了让平面石墨烯能够很好的与结合物进行固定，通常的做法是对平面石墨烯表面进行等离子处理，在平面石墨烯表面获得活性位点，也即在平面石墨烯表面嫁接各种轻水基团，但这种操作会破坏平面石墨烯的结构，从而导致平面石墨烯的导电性能下降，严重影响平面石墨烯作为生物传感器的电极载体的应用，这也就是为什么很多研究平面石墨烯作为生物传感器电极载体的文献，而没有真正实现产业应用化的原因。

2、目前常见的电流型便携式血糖测试仪使用的传感器，大部分是基于葡萄糖氧化酶(godx)催化氧化葡萄糖底物生成过氧化氢的反应，通过检测氧气的减少量或过氧化氢生成量来间接测定血液中的葡萄糖含量的.由于这种检测过氧化氢的方法灵敏度较高，所以被广泛应用。现有对血糖检测的传感器电极都是一次性使用，不能进行清洗后重复使用，使用传感器电极的成本高。

3、目前核酸检测是当前多种疾病确诊的重要依据，现阶段该技术操作要求高、检测时间长，需要配备昂贵的仪器和专人培训人员，给第一线的医疗检测资源带来了巨大压力。因此，发展快速准确、多指标联检、分布式(poct)，经济的病原体检测技术，高效防控具有重要意义。

4、因此，现有技术存在缺陷，需要改进。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：提供一种基底材料、血糖检测电极、核酸检测电极及制备方法，以解决背景技术中所提到的技术问题。

2、本发明的技术方案如下：提供一种血糖检测电极的制备方法，包括以下步骤。

3、s1：通过pecvd方法在基材表面生长出直立石墨烯，所述直立石墨烯具有三维类花瓣结构。基材选用陶瓷、二氧化硅、石英等绝缘材料。

4、s2：采用等离子体对直立石墨烯进行处理，获得活性位点，所述活性位点为：羧基、氨基、醛基、羟基中的至少一种。

5、s3：采用pepvd法，在直立石墨烯上生长可调节尺寸大小的au或pt纳米颗粒，所述au或pt纳米颗粒的尺寸为1-100nm，即获得基底材料。

6、s4：配置酶溶液：10-100mg/ml葡萄糖氧化酶+10-100mg/ml牛血清蛋白+1％-10％戊二醛，溶剂使用ph＝7.4±0.2、0.1±0.01mol/l无菌pbs缓冲液。

7、s5：在基底材料上点酶，点酶的量为0.1-1ul，密封放置于零下10℃-零上10℃的环境中静置4-24h，酶便附着在直立石墨烯表面；点酶的区域为工作电极区域。

8、s6：涂覆高分子包被膜，所述高分子包被膜为葡萄糖半透膜，高分子包被膜孔隙率：20％～30％。

9、所述高分子包被膜包括：孔径为100-400nm的多孔支撑层、孔径为10-30nm的微滤过滤层、孔径为0.1-6.0nm超滤表皮层；所述多孔支撑层附着在直立石墨烯表面，所述微滤过滤层夹在多孔支撑层与超滤表皮层之间。

10、所述超滤表皮层的孔径为0.8-1.0nm。

11、本发明还提供一种血糖检测电极，采用前述的血糖检测电极的制备方法制成。

12、直立石墨烯经过等离子体处理后，表面形成亲水基团，然后将葡萄糖氧化酶采用物理吸附(石墨烯多孔性能)及化学键合(亲水集团与酶)固定于电极表面，最后再覆一层高分子包被膜进一步固定酶，降低酶使用过程中的损失，从而实现重复血糖监测；血糖经过高分子膜，在铂金催化下，与葡萄糖氧化酶反应生成过氧化氢，电化学反应产生电流信号，经过电化学工作站的放大和模拟转换为对应血糖浓度。常用的酶主要包括葡萄糖氧化酶和葡萄糖脱氢。

13、本发明的血糖检测电极是可重复使用的直立石墨烯血糖检测电极用于血糖电化学检测，电极表面酶经过高分子膜固定，及一定条件清洗可以重复使用，降低电极使用成本，区别于传统平面酶电极，比传统电极更好的。

14、本发明还提供一种核酸检测电极的制备方法，包括以下步骤。

15、a1：通过pecvd方法在基材表面生长出直立石墨烯，所述直立石墨烯具有三维类花瓣结构。基材选用陶瓷、二氧化硅、石英等绝缘材料。

16、a2：采用等离子体对直立石墨烯进行处理，获得活性位点，所述活性位点为：羧基、氨基、醛基、羟基中的至少一种。通过等离子体的离子轰击和大π碳原子原位化学合成形成各种非六环大pi键合的碳原子点缺陷团簇(也即活性位点)，包含但不限于羟基、羧基和氨基基团等。

17、a3：偶联羧基功能化的聚合物，使直立石墨烯羧基化；聚合物的浓度为0.1-10mm，自组装时间为1-72h，温度10-50℃。

18、a4：通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)作为活化试剂，对羧基进行活化，edc与nhs的投料比为2:1-1:5，活化时间1-300min。

19、a5：采用pepvd法，在直立石墨烯上生长可调节尺寸大小的au或pt纳米颗粒，所述au或pt纳米颗粒的尺寸为1-100nm，即获得基底材料。

20、a6：配置核酸适体溶液，将核酸溶解在ph＝7.2-8.0的tris-hcl或pbs缓冲液中，核酸适体的摩尔浓度为1-10um。

21、a7：核酸适体固定在基底材料上，核酸适体固定的区域为工作电极区域；固定的方法为：化学共价偶联法、自组装法、亲和素&生物素法、物理吸附法中的任意一种。

22、所述化学共价偶联法：选择氨基修饰核酸链的一端，利用氨基与直立石墨烯上活化的羧基共价偶联形成酰胺键，将核酸适体固定在直立石墨烯上；固定温度：10-50℃，时间1-76h。

23、所述自组装法：选择巯基修饰核酸链的一端，利用巯基与直立石墨烯上的黄金纳米粒子之间的au-s键，将核酸适体固定到aunps、直立石墨烯上，固定温度：10-50℃，时间1-76h。

24、所述亲和素&生物素法：利用修饰亲和素的直立石墨烯和修饰生物素的核酸之间的高亲和反应来固定核酸适体，固定温度：10-50℃，时间1-76h。

25、所述物理吸附法：利用带正电的直立石墨烯与dna带负电的磷酸骨架之间的静电作用而实现对核酸适体的固定；固定温度：10-50℃，时间1-76h。

26、所述羧基功能化的聚合物包括但不限于hs-peg-cooh、cooh-peg-cooh、nh2-peg-cooh、ps-dvb-cooh、羧基化聚酰亚胺、马来酸酐-丙烯酸、丁二酸酐和聚乙烯醇、羧基化聚丙烯中的至少一种。

27、所述核酸适体其中核酸适体是单链的寡核苷酸，为ssdna和/或ssrna；所述核酸适体修饰基团包括但不限于巯基、氨基、羧基、醛基、甲基化、生物素中的至少一种；所述核酸适配体标记材料包括但不限于亚甲基蓝、二茂铁、罗丹明、酶促标记中的至少一种。

28、本发明还提供一种核酸检测电极，采用前述的核酸检测电极的制备方法制成。

29、本发明采用直立石墨烯薄膜复合纳米材料替代传统贵金属作为生物传感器敏感材料，直立石墨烯具有比表面积大、导电性好、反应活性位点丰富、生物相容性好等优异性能。另外核酸适体作为有一定立体结构的单链dna或rna分子，核酸适配体可通过化学合成得到，相较抗体等其他探针分子具有成本低，易于引入基团修饰，性质稳定的等诸多优点。将直立石墨烯与核酸生物分子复合，制成直立石墨烯核酸纳米生物电极，采用电化学检测手段，该检测技术具有高灵敏度、快速、污染少、成本低和易于分布式检测(poct)等优势，适合于病原微生物分子高通量快速检测的多项要求。

30、采用上述方案，本发明提供一种血糖检测电极、核酸检测电极及制备方法，通过pecvd方法生长的直立石墨烯，具有三维类花瓣结构，该结构下的直立石墨烯比平面石墨烯更坚固，可用于等离子体的方式进行羧基、氨基、醛基、羟基等化学基团的嫁接，通过这种方法引入基团，不但没有破坏直立石墨烯的结构及导电性，更有利于核酸和抗体占据活性位点，负载更多的核酸、抗体，提高电化学检测信号，另外还可省掉封闭这一步骤，避免干扰。该方法可实现工业化生产。