一种测定羧甲基壳聚糖含量的方法

本发明属于多糖衍生物类分析检测领域，涉及一种测定羧甲基壳聚糖含量的方法。

背景技术：

1、羧甲基壳聚糖作为壳聚糖常见的衍生物之一，是一种研究较早而且效果相对较好的改性衍生物以增强壳聚糖的水溶性。其本身具备独特优越的水溶性、成膜性、絮凝性、生物相容性和生物降解，比起壳聚糖拥有更好的抗菌活性，并且无毒无害对人类安全，且有研究表明：羧甲基壳聚糖有利于人体正常细胞的生长，能够增强人体免疫力，而对于肿瘤细胞却体现出相反的破坏生长的能力，能够有效的控制癌细胞的生长繁殖，从而起到一定的抗癌抑癌作用，潜在价值不可估量，因此受到越来越广泛的关注，已被广泛用于化妆品、食品加工、环境保护、农业、印染、高分子材料、功能催化剂、医药和生物保健品等领域。

2、羧甲基壳聚糖是一种衍生化水溶性功能多糖，在结构上属于葡萄糖胺聚糖，近年来应用范围不断扩大，因此需要建立其产品质量分析方法，以便于进行质量控制。目前，常见的测定羧甲基壳聚糖含量的方法有：库仑滴定法、凯氏定氮法、刚果红显色法、荧光猝灭法、3,5－二硝基水杨酸比色法、测定糖醛酸的硫酸咔唑法和测定葡萄糖胺的乙酰丙酮法等。这些方法都有存在不同程度的不足，如凯氏定氮法间接测定羧甲基壳聚糖含量，该方法分析过程包含样品破坏、氨气蒸馏与弱碱滴定等步骤，操作较为繁琐、用时较长且复杂样品的滴定终点颜色变化难以判断；刚果红显色法、荧光猝灭法和3,5－二硝基水杨酸比色法等，方法检测范围较窄，检测波长下干扰因素较多；库仑滴定法是一种建立在控制电流电解基础上测定常量、微量、半微量及痕量组分的电化学分析方法，与传统滴定方法相比，具有分析快速，无需提前配制、标定标准溶液，自动确定滴定终点等优点，但一受电流影响，操作不易控制，准确度容易被影响，应用也受到局限。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种测定羧甲基壳聚糖含量的方法。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、一种测定羧甲基壳聚糖含量的方法，确定待测羧甲基壳聚糖的脱乙酰度及取代度，而后对待测羧甲基壳聚糖进行酸处理-席夫碱修饰，然后对修饰后的酸处理-羧甲基壳聚糖席夫碱进行水解，得到水解液，最后进样hplc检测水解液中的水解成盐产物，进而转化计算得到羧甲基壳聚糖含量。

4、采用核磁共振波谱技术测定并计算得到壳聚糖原料的脱乙酰度，选定五个不同脱乙酰度的壳聚糖进行试验，脱乙酰度分别为60-70％、72-78％、80-86％、88-93％、95-99％。

5、具体为：

6、1)酸处理-羧甲基壳聚糖席夫碱试样制备：取确定脱乙酰度及取代度的待测羧甲基壳聚糖，加入浓盐酸，加热反应0.3-6h，烘干去除多余盐酸，得酸处理-羧甲基壳聚糖样品，然后将水加入到干燥至恒重的酸处理-羧甲基壳聚糖样品中，并调ph为7-10，加入乙醇溶胀0.2-2h，而后加入醛，加热回流0.5-8h，反应结束后烘干，得到酸处理-羧甲基壳聚糖席夫碱试样；

7、2)水解液试样的制备和测定：将浓盐酸加入到烘干至恒重的酸处理-羧甲基壳聚糖席夫碱试样中，加热条件下进行酸水解，得羧甲基壳聚糖待测水解试样溶液；取水解液试样溶液适量，过0.22μm针头过滤器滤膜，hplc进样检测，由标准曲线获得水解成盐产物浓度，得其含量，进而转化计算得到羧甲基壳聚糖的含量。

8、分别采用核磁共振波谱技术或元素分析技术测定制备羧甲基壳聚糖的取代度。

9、上述羧甲基壳聚糖试样制备：分别取已选定的壳聚糖原料适量，溶胀于异丙醇-水溶液中0.5-3h，分批加入1-10mol/l的氢氧化钠溶液，搅拌碱化1-5h，随后分次加入氯乙酸，加热反应0.5-7h，加冰醋酸调ph为5-8，而后用60-95％乙醇水溶液停止反应，过滤，用70-95％乙醇水溶液洗涤产物，冷冻干燥，得羧甲基壳聚糖试样，备用；

10、所述酸处理过程中，加入的羧甲基壳聚糖与浓盐酸用量比值为10:2～60:40(mg:ml)，席夫碱制备时所用醛为苯甲醛或正丙醛；壳聚糖原料用量与乙醇的加入量及醛的加入量比值为5:2:4～80:45:75(mg:ml:mol)。

11、所述酸水解时加热温度为90～140℃。

12、以水解成盐产物氨基葡萄糖盐酸盐为标准品，配制一系列标准溶液，hplc检测，以氨基葡萄糖盐酸盐浓度对数值为横坐标，以对应的峰面积对数值为纵坐标绘制标准曲线；色谱条件为：采用venusii hilic色谱柱，流速为0.3-1.2ml/min，进样量为10-50μl，柱温为25-45℃，流动相为乙腈-0.05％磷酸水溶液(85:15，v/v)，检测器为蒸发光散射检测器。

13、取制备的待测水解液试样溶液适量，过0.22μm针头过滤器，hplc色谱条件进样检测，由标准曲线计算得到酸处理-羧甲基壳聚糖席夫碱在酸性条件下水解形成盐的浓度，并经公式(1)、(2)、(3)转化计算得到羧甲基壳聚糖的含量；

14、

15、mr2＝161.2×dd+203.19×(1-dd)+80×ds         (2)

16、

17、

18、其中公式(1)(2)(3)(4)中，

19、w—羧甲基壳聚糖含量，％；

20、m—制备的羧甲基壳聚糖粉末固体质量，g；

21、c—由标准曲线获得的酸处理-羧甲基壳聚糖席夫碱在酸性条件下水解形成盐的浓度，mg/ml；

22、v—酸水解待测溶液体积，ml；

23、mr1—酸处理-羧甲基壳聚糖席夫碱在酸性条件下水解形成盐的摩尔质量，g/mol；

24、mr2—羧甲基壳聚糖的摩尔质量，g/mol；

25、dd—壳聚糖原料的脱乙酰度，1；

26、ds—羧甲基壳聚糖的取代度，1；

27、∫acmcs-h—羧甲基壳聚糖上h在1h nmr谱图上积分面积，1；

28、∫ac2-h—羧甲基壳聚糖c2上h在1h nmr谱图上积分面积，1；

29、∫bcoch3-h—壳聚糖原料乙酰氨基h在1h nmr谱图上积分面积，1；

30、∫bc2,3,4,5,6-h—壳聚糖原料c2上h在1h nmr谱图上积分面积，1。

31、与现有技术相比，本发明有益效果在于：

32、1.本发明测定方法首先制备羧甲基壳聚糖，在采用核磁氢谱技术准确测定壳聚糖原料脱乙酰度的基础上，能够将制备得到的羧甲基壳聚糖采用核磁氢谱准确计算取代度，这对羧甲基壳聚糖的分子量准确计算有重要意义。

33、2.本发明并未直接水解制备的羧甲基壳聚糖，而是创新性的先采用酸处理技术断裂6位c-o键，而后又将酸处理后的羧甲基壳聚糖制备成席夫碱形式，有利于羧甲基壳聚糖水解彻底，从而提高水解液中水解成盐产物，使得到的羧甲基壳聚糖含量更为准确。

34、3.本发明采用质量无损失技术，简化操作步骤，节省实验材料，降低实验成本，将制备得到的羧甲基壳聚糖依次进行酸处理、席夫碱修饰及酸水解，最终通过hplc检测的水解液中水解成盐产物的浓度及计算公式，可准确地转化计算得到羧甲基壳聚糖的含量。

35、4.本发明避免了羧甲基壳聚糖取代度不同对含量测定的影响，并采用准确性好、分离效果明显、灵敏度高、检出限低的高效液相色谱法测定单糖含量，结合采用通用型蒸发光散射检测器，克服了糖类物质本身不具有发光基团，紫外吸收弱，不易被检测的困难，操作简单，应用性强。

36、5.本发明方法通过制备羧甲基壳聚糖，酸处理-席夫碱修饰，水解，hplc测定一系列技术，不仅解决了直接水解羧甲基壳聚糖不彻底的问题，而且水解成盐产物可以直接被检测定量，无需额外衍生化引入杂质，简化了操作过程，降低了检测成本，为羧甲基壳聚糖含量测定提供了一个便洁、准确的技术路线，解决了当前市面上准确定量羧甲基壳聚糖含量技术匮乏的难题，便于对羧甲基壳聚糖相关产品进行质量控制，为羧甲基壳聚糖含量测定提供技术支持和指导，对于推动羧甲基壳聚糖产业发展具有重要的理论和现实意义。