一种口含式唾液抗新型冠状病毒S蛋白分泌型IgA抗体检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种口含式唾液抗新型冠状病毒s蛋白分泌型iga抗体检测试剂盒。

背景技术：

1、新型冠状病毒目前有5种“关切的变异株”，分别为阿尔法(alpha)、贝塔(beta)、伽玛(gamma)、德尔塔(delta)和奥密克戎(omicron)。患者症状主要表现为发热、干咳、乏力。也有一部分患者以鼻塞、流鼻涕、咽痛、嗅觉和味觉减退或丧失、结膜炎、肌肉疼痛以及腹泻等为主要表现。多数患者预后良好，部分严重病例可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。

2、呼吸道黏膜免疫系统是黏膜免疫系统的一个重要组成部分，是机体最先接触大量病毒、细菌等吸入性抗原的部位。呼吸道黏膜表面是机体与外环境之间的一道有效的防御屏障，其最主要的特征是产生分泌型免疫球蛋白a(secretoryimmunoglobulina，siga)。siga被认为是黏膜表面的免疫屏障，它能有效的抑制病原体粘附、定植或侵入黏膜表面，这种免疫排除作用能保护黏膜屏障的完整性和阻断病原体对机体的感染。分泌型iga存在于分泌液中，如唾液、泪液、初乳、鼻和支气管分泌液、胃肠液、尿液、汗液等。人感染新冠病毒后，呼吸道黏膜会分泌抗新冠病毒抗原的siga，作为防止再次感染的第一道屏障。另外，目前上市的鼻喷式和口吸入式疫苗正是应用疫苗激发呼吸道黏膜产生抗新冠病毒siga抗体的原理。

3、目前新冠抗体检测试剂主要检测血清igm、igg水平，但血清抗体一般保护不了呼吸道和消化道粘膜，而新冠病毒是从呼吸道粘膜侵入人体的，所以即使有高的血清抗体水平，也很难阻止新冠病毒对呼吸道粘膜的侵染。而siga是呼吸道、消化道粘膜分泌型抗体，对防止感染起到第一道屏障作用。另外，目前测血清igm,igg的试纸条基本都是针对n蛋白的，n蛋白在病毒的核心，n蛋白抗体对阻断感染不起作用，病毒是通过其外壳表面的s蛋白作用人体细胞而侵入的，所以n蛋白抗体水平高也说明不了抗感染能力。

4、因此，发明一个简便、经济、可快速检测唾液中的抗新冠病毒s蛋白的siga抗体对新冠病毒感染康复后复阳可能性的评估、以及给于鼻喷式或吸入式新冠疫苗后疫苗的时效性评估非常有意义，是全球新冠疫情防控必不可少的手段。

技术实现思路

1、针对目前新冠抗体检测试剂的问题，本技术以唾液中抗新冠病毒s蛋白抗原的siga为靶标，发明了一种口含式唾液抗新型冠状病毒s蛋白分泌型iga抗体检测试剂盒。采用免疫层析试纸条的方法，将具天然活性的新型冠状病毒omicron株的s蛋白，标记于胶体金、胶体碳、彩色乳胶、磁珠或荧光微球，并包埋于免疫层析试纸条的释放垫，用于捕获被测样本中抗新冠病毒s蛋白的分泌型iga；用人源黏膜分泌型siga免疫小鼠制备高亲和力的抗人源siga单克隆抗体，并将抗体包被于试纸条的检测线(t)；免疫层析试纸条的样本垫叠放一块唾液吸附片，这样试纸条就可以直接口含检测唾液中抗新冠病毒的口腔黏膜siga。

2、除了具有快速、简便、廉价、稳定性好、可实现居家检测等优点外，本发明的优势关键在于可以作为新冠病毒感染康复后复阳可能性的评估、以及给于鼻喷式或吸入式新冠疫苗后疫苗的时效性评估的快检试剂，对疫情防控具有重要意义。

3、进一步地，所述标记胶体金、胶体碳、彩色乳胶、磁珠或荧光微球的新型冠状病毒omicron株的s蛋白，具体选择为胶体金标记的新冠病毒omicron变种毒株xbb1.5的重组s蛋白，其制备方法包括以下步骤：

4、1)将新冠病毒omicron变种毒株xbb1.5的s蛋白胞外域s1蛋白基因的c端顺序接上柔性多肽序列和纯化标记标签形成人工设计序列，该人工设计序列经宿主细胞密码子优化后，亚克隆到一个含有ef1启动表达荧光蛋白的载体的cmv启动子下，构建表达新冠病毒omicron变种毒株xbb1.5的s蛋白-纯化标记标签融合蛋白的质粒，简称为xbb-s1融合蛋白质粒；

5、2)将步骤1)构建好的表达xbb-s1融合蛋白的质粒转染到真核永生化细胞，并建立表达xbb-s1融合蛋白的基因稳转细胞系，进行培养扩增得到含xbb-s1融合蛋白的培养上清液；

6、3)用蛋白纯化柱从步骤2)制备的含xbb-s1融合蛋白的培养上清液中获得xbb-s1融合蛋白；

7、4)利用xbb-s1融合蛋白未端标记标签将xbb-s1融合蛋白定向偶联于链霉亲和素化的胶体金，获得胶体金标记的新冠病毒omicron变种毒株xbb1.5的重组s蛋白，将其命名为cg-st-xbb1.5s1。

8、进一步的，步骤1)中，所述新冠病毒omicron变种毒株xbb1.5的s蛋白胞外域s1部分，包括了t19i,del24-26,a27s,v83a,g142d,y144del,h146q,q183e,v213e,g339h,r346t,l368i,s371f,s373p,s375f,t376a,d405n,r408s,k417n,n440k,v445p,g446s,n460k,s477n,t478k,e484a,f486p,f490s,q498r,n501y,y505h,d614g,h655y突变位点；所述柔性多肽序列为gsggsggsaggg；所述纯化标记标签为streptagii，其多肽序列为wshpqfek；所述密码子优化的宿主为人；所述含有ef1启动表达荧光蛋白的载体为慢病毒表达载体pcdh-cmv-mcs-ef1-tagrfp，ef1启动表达的荧光蛋白为红色荧光蛋白tagrfp，构建好的xbb-s1融合蛋白的质粒命名为pcdh-xbb1.5s1.rfp。

9、其中，在新冠病毒xbb1.5毒株的s1蛋白的c端顺序接上柔性多肽序列和纯化标记标签形成的人工设计序列经宿主细胞密码子优化后的核酸序列如seq id no：1所示，构建好的pcdh-xbb1.5s1.rfp质粒所表达的xbb-s1融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。

10、进一步的，步骤2)中，所述真核永生化细胞为人胚肾细胞293，建立表达xbb-s1融合蛋白的基因稳转细胞系为xbb1.5s1.rfp/293。

11、其中xbb1.5s1.rfp/293稳转细胞系的建立过程为：将pcdh-xbb1.5s1.rfp质粒、ph1质粒、ph2质粒共转染到慢病毒包装系细胞293v，制备xbb1.5s1.rfp慢病毒，并转染人胚肾细胞293，荧光显微镜下挑取高表达阳性克隆建立xbb1.5s1.rfp/293稳转细胞系。

12、进一步的，步骤3)中，所述蛋白纯化柱中的介质为strep-tactin层析介质，纯化后的蛋白为c末端带有柔性多肽序列gsggsggsaggg和strep tagii标签的新冠病毒xbb1.5株的s1蛋白，命名为xbb1.5s1。

13、进一步的，步骤4)中，所述链霉亲和素化的胶体金为strep-tactin标记的胶体金，命名为cg-st；将xbb-s1融合蛋白命名为xbb1.5s1蛋白，它是c末端带有柔性多肽序列gsggsggsaggg和streptagii标签的新冠病毒xbb1.5株的s1蛋白。所述定向偶联方法制备cg-st-xbb1.5s1包括以下过程：

14、在ph7.4的pbs缓冲液中将cg-st和xbb1.5s1蛋白混合，于37℃水浴、100-150rpm振荡共孵育0.5-2小时，xbb1.5s1的streptagii标签与cg-st的strep-tactin稳固结合，然后12000g离心30分钟，弃上清，沉淀用ph7.4的pbs缓冲液复溶清洗2-3分钟，再次12000g离心30分钟，弃上清，沉淀用喷金稀释液复溶至od值为100的胶体金标记xbb1.5s1溶液，cg-st以标记的strep-tactin蛋白计与带有streptagii标签的xbb1.5s1蛋白的摩尔比为1:3-5，最终得到的胶体金标记xbb1.5s1产物标识为cg-st-xbb1.5s1，该标记法加上标记标签前面的柔性多肽连接使xbb1.5s1蛋白可以充分地展示于胶体金表面从而最大效率地捕获样本中的抗新冠s1的siga抗体，提高试剂检测灵敏度和特异性。

15、进一步的，所述试剂盒包含高效价抗人源分泌型iga(siga)单克隆抗体，其制备方法如下：

16、以人源分泌型iga(即siga)作为免疫原，与501佐剂混合免疫小鼠，四次免疫后釆用elisa检测血清效价，直接梯度稀释效价至少达到100万分之一，符合融合要求；采用小鼠单克隆抗体制备技术筛选制备高亲和力和特异性好的单克隆抗体，kd值≤10-9，且与人igg、igm、ige没有交叉反应，标识为anti-hsigamab，即制得高亲和力的抗人源siga单克隆抗体。

17、进一步的，所述试剂盒还包括免疫层析试纸条，免疫层析试纸条包括底衬、硝酸纤维素膜、样品垫、释放垫、吸水纸和唾液吸附片；样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接组装在底衬上，释放垫和吸水纸分别叠压在硝酸纤维素膜的两端，并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区，样品垫叠压在释放垫上，唾液吸附片一端部分搭压在样品垫上；检测区的硝酸纤维素膜上，从靠近释放垫到靠近吸水纸依次设置检测线区t和控制线区c。将兔igg标记于胶体金，标识为cg-rigg；将cg-st-xbb1.5s1和cg-rigg混合后喷涂在免疫层析试纸条释放垫上，并在硝酸纤维素膜上的t线区包被anti-hsigamab；c线区的硝酸纤维素膜上包被羊抗兔igg多抗(gar)。

18、进一步的，所述试剂盒适用唾液、鼻和支气管分泌液、泪液、初乳、胃肠液、尿液、汗液等样本的检测，应用于新型冠状病毒感染后呼吸道和消化道粘膜siga检测能作为是否有再次感染的风险评估。

19、进一步的，所述试剂盒还适合鼻喷式和口吸入式新冠疫苗使用后抗新型冠状病毒siga产生与否及效价的评估。

20、人感染新冠病毒、给于鼻喷式或吸入式新冠疫苗后在呼吸道、肠道黏膜都能产生抗新冠病毒抗原的分泌型免疫球蛋白a(secretory immunoglobulina,siga)。黏膜siga是抗病毒感染的第一道屏障，尤其是新冠病毒是通过呼吸道入侵人体，而血清抗体又无法到达呼吸道表面，所以监测新冠病毒感染康复后呼吸道黏膜siga的水平对评估复阳的可能性、以及监测给于鼻喷式或吸入式新冠疫苗后黏膜siga的水平对评估疫苗的时效性非常有意义，是全球新冠疫情防控必不可少的手段。本发明基于此原理，本发明提供了一种口含式唾液抗新型冠状病毒s蛋白分泌型iga抗体检测试剂盒，检测新冠感染后病人的唾液siga阴阳性结果具有很好的准确性。

21、本技术文件中的人源分泌型iga即为siga。