一种N-MID骨钙素测定试剂盒及其制备、检测方法与流程

本发明涉及免疫学测定，尤其涉及一种n-mid骨钙素测定试剂盒及其制备、检测方法。

背景技术：

1、骨钙素是成熟成骨细胞分泌的一种非胶原骨基质蛋白，占骨基质中非胶原蛋白成分的25﹪，骨总蛋白的2﹪。完整的骨钙素有49个氨基酸组成，相对分子质量为5800。血清中的骨钙素具有多样性，约三分之一为完整骨钙素，三分之一为n-mid骨钙素(n-midosteocalcin)片段，三分之一为氨基酸短肽。骨钙素是成骨细胞功能和骨质矿化的特殊标志物，作为骨转换标志物逐渐被临床应用。

2、目前，市场上n-mid骨钙素测定试剂盒以免疫学方法为主，但是现有的检测方法存在一定的缺陷，检测步骤繁琐，操作难度较大，且检测的效率低，精密性不佳，检测的结果受操作的影响，并且价格较高。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于胶乳增强免疫比浊法的n-mid骨钙素测定试剂盒及其制备、检测方法，可实现全自动生化分析仪检测n-mid骨钙素，且操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、成本低。

2、本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

3、一种n-mid骨钙素测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2；

4、所述试剂r1包括：tris缓冲液10～100mmol/l，海藻糖10～50g/l，genapol x-0801～5g/l，羟乙基纤维素10～30g/l，蛋白保护剂5～30g/l，防腐剂0.5～1.5g/l；

5、所述试剂r2包括：tris缓冲液10～100mmol/l，海藻糖5～10g/l，genapol x-0800.1～5g/l，n-mid骨钙素单克隆抗体50～100mg/l，乳胶微球颗粒0.5％～3％，蛋白保护剂1～20g/l，防腐剂0.1～5g/l。

6、作为本发明的优选方式之一，所述试剂r1和试剂r2中的蛋白保护剂为甘油、牛血清白蛋白、酪蛋白、小牛血清、蔗糖中的一种或多种。

7、作为本发明的优选方式之一，所述试剂r1和试剂r2中的防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、proclin300中的一种或多种。

8、作为本发明的优选方式之一，所述试剂r2中，n-mid骨钙素单克隆抗体为鼠抗人n-mid骨钙素单克隆抗体、羊抗人n-mid骨钙素单克隆抗体、兔抗人n-mid骨钙素单克隆抗体中的至少一种。

9、作为本发明的优选方式之一，所述试剂r2中，乳胶微球颗粒的粒径为150～400nm；所述乳胶微球颗粒与n-mid骨钙素单克隆抗体交联反应结合，形成包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；该过程中，hepes缓冲液作为偶联缓冲液，gly缓冲液作为稀释缓冲液。

10、作为本发明的优选方式之一，所述包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球的制备方法为：

11、①取胶乳微球加入到偶联缓冲液中混合均匀，接着置于恒温搅拌器中预热15～25min，温度：30～37℃；

12、②加入活化剂edc溶液和nhs溶液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应10～20min，温度：30～37℃；

13、③加入n-mid骨钙素单克隆抗体，混匀，并置于恒温搅拌器中反应100～140min，温度：30～37℃；

14、④加入封闭液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应25～35h，温度：30～37℃；

15、⑤置于高速离心机中10000～20000rpm离心10～30min，温度：0～10℃；

16、⑥加入稀释缓冲液，置于冰水浴中，放置于超声波细胞破碎仪中充分分散3～10min，功率200～300w。

17、一种n-mid骨钙素测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

18、(1)配制试剂r1：

19、按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；

20、(2)配制试剂r2的稀释缓冲液：

21、按照试剂r2的组分含量，将tris缓冲液、海藻糖、genapol x-080、蛋白保护剂、防腐剂进行混合，获得试剂r2的稀释缓冲液；

22、(3)配制试剂r2：

23、①取胶乳微球加入到偶联缓冲液中混合均匀，接着置于恒温搅拌器中预热15～25min，温度：30～37℃；

24、②加入活化剂edc溶液和nhs溶液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应10～20min，温度：30～37℃；

25、③加入n-mid骨钙素单克隆抗体，混匀，并置于恒温搅拌器中反应100～140min，温度：30～37℃；

26、④加入封闭液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应25～35h，温度：30～37℃；

27、⑤置于高速离心机中10000～20000rpm离心10～30min，温度：0～10℃；

28、⑥加入稀释缓冲液，置于冰水浴中，放置于超声波细胞破碎仪中充分分散3～10min，功率200～300w，制得包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；

29、⑦将包被有n-mid骨钙素单克隆抗体的胶乳微球加入到步骤(2)制得的稀释缓冲液中，并置于恒温搅拌器中充分分散30～40min，温度：30～37℃，制得试剂r2。

30、一种n-mid骨钙素测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

31、(1)吸取5μl样本，加入60μl试剂r1，37℃孵育3～5min；

32、(2)再加入180μl试剂r2，置于37℃孵育；

33、(3)孵育20s后，采用全自动生化分析仪，于570nm波长下测定吸光值al；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值a2；

34、(4)按照△a＝a2-a1来计算吸光度变化值δa，并根据δa计算出样本中n-mid骨钙素含量。

35、本发明基于胶乳增强免疫比浊法测定的n-mid骨钙素试剂盒，其原理是采用化学偶联法将特异性抗体结合于一定粒径的胶乳颗粒表面，当交联有抗体的微球与抗原结合后，短时间内迅速聚集在一起，从而改变反应液的吸光度。可以使用全自动生化分析仪检测n-mid骨钙素，根据吸光度增加量，即可在特定波长处测定免疫复合物浊度，定量检测血清中的n-mid骨钙素含量，具有操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、检测结果不受操作影响并且价格上会有很大的优势

36、重要成分功效：

37、海藻糖：海藻糖是由两个葡萄糖分子组成的一个非还原性双糖，对生物活性分子有非特异性保护作用，能够在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在生物活性物质表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质等生物分子结构不被破坏，对酸碱也具有良好的稳定性，使抗原抗体保持天然构象。

38、羟乙基纤维素(hec)：羟乙基纤维素为白色至淡黄色纤维状或粉状固体，无毒、无味、易溶于水，不溶于一般有机溶剂，具有增稠、悬浮、粘合、乳化、分散、保持水分等性能，可制备不同粘度范围的溶液，对电解质具有异常好的盐溶性，在胶乳试剂中作乳胶增稠剂、胶体保护剂具有良好的增敏作用。

39、genapol x-080：相较于应用于生化试剂的传统表面活性剂，genapol x-080作为一种非离子表面活性剂，具有更好的稳定性、抗脂浊性、分散性、低泡性，不会对胶乳的结合反应产生干扰的同时有很强的抗干扰作用。

40、本发明相比现有技术的优点在于：

41、(1)本发明基于胶乳增强免疫比浊法，可实现全自动生化分析仪检测n-mid骨钙素，且操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、成本低；

42、(2)本发明在试剂配方中增加海藻糖，可有效保护蛋白质等生物分子结构不被破坏，对酸碱也具有良好的稳定性，使抗原抗体保持天然构象，从而提高试剂的稳定性；

43、(3)本发明在试剂配方中增加羟乙基纤维素，具有有效的增敏作用，进而大大提高试剂的检测灵敏度、重复性；

44、(4)本发明在试剂配方中增加genapol x-080作为表面活性剂，其相对于传统的吐温-20等表面活性剂，genapol x-080具有更好的稳定性、抗脂浊性、分散性、低泡性，不会对胶乳的结合反应产生干扰的同时有很强的抗干扰作用。