居家自测炎症五项联合检测试剂盒及其检测卡和应用的制作方法

本发明涉及一种居家自测炎症五项联合检测试剂盒及其检测卡和应用。

背景技术：

1、细菌和病毒是引起炎症的主要病原体，临床上非常容易混淆，炎症标志物在鉴别细菌病毒感染，病情早期预警，诊治疗效监测，预后评估等方面有重要意义。同时减少不恰当的抗生素应用是控制抗生素耐药的主要策略。而准确诊断感染源，区分病原体种类是细菌性感染还是病毒性感染，从而对症用药则是重中之重。

2、人类c反应蛋白(c-reactive protein，crp)是指在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质(急性蛋白)。crp由肝细胞所合成，存在于健康人血液中，正常情况下，机体crp浓度较低，在急性创伤和感染时其血浓度急剧升高。crp是鉴别细菌感染或病毒感染最有效的检验，被用于观察多种疾病的状况，在炎症或组织损伤的情况下的非特异性标志物，crp是临床上最常用的急性时相反应指标。

3、血清淀粉样蛋白a(serum amyloid a，saa)是组织淀粉样蛋白a的前体物质及敏感的正急性时相反应蛋白。某些疾病，如病毒感染，移植排斥反应、冠心病等，saa的敏感性高于crp，可为临床提供更好的参考价值。临床上患者出现发热，一般都会测crp，在判断感染原因时，一般认为crp不升高即为病毒感染。如此判断是不够合理准确的。容易将其他各类因素引起的发热归结于病毒感染，引起误诊。saa对病毒变化非常敏感，因此联合检测saa和crp，让临床鉴定细菌病毒感染更为靠谱。

4、pct对机体感染的反应具有快速准确的特征，是一种理想的生物标志物。血清pct在感染性疾病诊断方面具有较高的敏感性和特异性，不但可早期鉴别诊断细菌性或非细菌性感染,而且与感染的严重程度呈正相关性关系。白介素6是细胞因子网络中的重要成员，在急性炎症反应中处于中心地位，可介导肝脏的急性期反应，刺激c反应蛋白和纤维蛋白原的生成。多种感染性疾病可导致血清il-6水平升高，而且il-6水平与患者预后密切相关。在脓毒症的全病程管理中，il-6和pct联合检测可以取长补短，提高诊断的准确率。il-6在早期预警及评估预后方面优势突出，而pct在辅助诊断、评估检测抗生素疗效方面非常有效。联合检测il-6和pct可以避免单一指标对感染类别判断的误差，提高感染的早期诊断，及时帮助临床确定患者的治疗方案，具有重要临床价值。

5、肝素结合蛋白(hbp)是中性粒细胞来源的颗粒蛋白，专家共识指出hbp作为一种急性时相蛋白，是评估脓毒症患者疾病严重程度的有效生物标志物，在脓毒性休克患者的早期诊断和疗效监测中更为重要。

6、现有技术中炎症仅针对单一的指标或者二联指标进行检测，炎症五项联合检测较少，另外目前常用做标记的探针有胶体金，荧光微球，上转换纳米晶或量子点等。对于胶体金探针而言，仅能提供定性或半定量检测，且灵敏度低假阳率高。对于荧光微球和量子点，灵敏度高，可以定量检测，但是需要紫外光激发，背景值高且需要借助仪器定量分析，无法通过肉眼比色定性判断。对于上转换纳米晶，呈现出许多优点，例如低毒性，高化学稳定性，窄带发射，较大的反斯托克位移，较深的光穿透深度和空间分辨率，对生物组织无损伤等，但通常因为结构上的缺陷上而导致上转换发光效率低，同时小的吸收截面也导致了它的激发效率受到限制。因此应用于高敏感度医学和生物探测仍然受到一定限制。目前已经研究出一些方法，例如包裹二氧化硅壳，制造核壳结构，gd3+离子掺杂，引入贵金属纳米粒子等。现有报道中直接与金形成异质结所得纳米探针的均匀性和单分散性较差，因此在作为检测探针的应用中存在局限，同时在合成中难以控制金的等离子体吸收峰与上转换发射峰匹配，无法充分应用等离子体发射增强效果。

7、因此基于一种上转换荧光强度高、背景干扰小、灵敏度高、单分散性好、可实现比色/荧光双模态检测的上转换增强发光比色纳米探针，开发出可实现居家自测且具有检测范围宽、灵敏度高、能够快速测定血液中pct/il-6/saa/crp/hbp的含量的居家自测炎症五项联合检测试剂盒和检测方法具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的不足和缺陷，提供一种居家自测炎症五项联合检测试剂盒及其检测卡和应用。

2、实现本发明目的的技术方案是：居家自测炎症五项联合检测卡，包括卡壳和设置在卡壳内的检测试纸条；所述检测试纸条包括底衬以及沿衬底的长度方向顺次搭接粘贴在底衬上的样品垫、包被膜和吸水纸；所述样品垫喷涂有微球线；所述微球线为双模态纳米探针标记的crp1/saa 1/pct1/il-6 1/hbp 1单克隆抗体和兔igg抗体；所述包被膜包括硝酸纤维素膜以及沿长度方向依次平行间隔设置于硝酸纤维素膜上的第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和质控线；所述第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和质控线分别包被crp2/saa 2/pct2/il-62/hbp 2和羊抗兔抗体，其中第一检测线靠近样品垫，质控线远离样品垫。

3、进一步地，所述样品垫上喷涂的双模态纳米探针标记的crp1/saa 1/pct1/il-61/hbp 1单克隆抗体和兔igg抗体的含量均为20～200μg抗体/200μl荧光微球。

4、进一步地，所述双模态纳米探针为上转换增强发光比色纳米探针。

5、进一步地，所述双模态纳米探针在980nm激发光下，其荧光光谱发射峰位于520-550nm和640-680nm的范围内。

6、进一步地，所述双模态纳米探针以包覆有二氧化硅纳米颗粒的银离子为核，该核外包覆有上转换纳米晶层和外硅层。

7、进一步地，所述上转换纳米晶层为核壳结构，其组成为：镱铒共同掺杂的氟化钇钠包覆氟化钇钠壳层，即nayf4:yb,er@nayf4。所述上转换纳米晶层平均粒径为30-50nm。所述纳米银的平均粒径为80-120nm；所述内硅层为二氧化硅层，所述二氧化硅层的厚度为10-30nm。

8、进一步地，所述双模态纳米探针粒径为190nm。

9、本发明中，上转换纳米晶呈现出许多优点，例如低毒性，高化学稳定性，窄带发射，较大的反斯托克位移，较深的光穿透深度和空间分辨率，对生物组织无损伤等，此外，稀土上转换发光只需要低功率密度的近红外连续激光器(典型的激发波长为980nm)，同时引入纳米银用于金属增强荧光，产生于荧光团和纳米银等离子体共振的相互作用，导致金属纳米微粒周围的局域电磁场增强，从而增强激发效率，同时使荧光团的辐射衰变速率亦随之增强，这两方面都共同作用增强荧光团的荧光强度。另外纳米银的引入还可以增加检测的可视化。

10、进一步地，所述硝酸纤维素膜上的第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和质控线的间隔距离为2～4mm。

11、进一步地，所述硝酸纤维素膜上的crp 2/saa 2/pct 2/il-6 2/hbp 2单克隆抗体包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，羊抗兔igg抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。

12、进一步地，所述检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

13、步骤一：合成氟化钇钠核结构：在容器中，加入油酸、1-十八烯、铒的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、naoh和氟化铵甲醇混合溶液，并进行反应；随后用环己烷乙醇混合液洗涤，分散于环己烷中，得到nayf4:yb,er纳米探针环己烷溶液；

14、步骤二：制备核壳结构双模态纳米探针：在容器中，加入油酸、1-十八烯、醋酸钇、naoh和氟化铵甲醇混合溶液、nayf4:yb,er纳米探针环己烷溶液，并进行反应，用环己烷乙醇混合液洗涤3次，分散于环己烷中，得到含上转换纳米晶的环己烷溶液，然后利用酸洗的方法将上转换纳米晶转移到乙醇中，得到含上转换纳米晶的乙醇溶液；

15、步骤三：制备二氧化硅包覆的纳米银：在容器中，加入乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮乙二醇、硝酸银乙二醇溶液反应后通过冰水浴烧瓶进行猝灭反应，然后加入丙酮、乙醇洗涤3～4次，得到纳米银。将纳米银分散在异丙醇中，得到纳米银溶液，搅拌的条件下依次加入水、5％四乙氧基硅烷异丙醇溶液和氨水，搅拌后，离心并用乙醇洗涤3次，得到二氧化硅包覆的纳米银；

16、步骤四：将所述二氧化硅包覆纳米银分散在乙醇中，加入步骤一得到的含上转换纳米晶的乙醇溶液，离心去除过量上转换纳米晶后，将得到的材料分散在乙醇中，并依次加入水、10％四乙氧基硅烷乙醇溶液和氨水，搅拌后离心洗涤，得到上转换增强发光比色纳米探针；

17、步骤五：将所述上转换增强发光比色纳米探针和氨丙基三乙氧基硅烷在60℃下混合并搅拌，离心分散在n,n二甲基甲酰胺(dmf)溶剂中，再加入丁二酸酐dmf溶液，并搅拌，洗涤分散在水中，得到羧基修饰的上转换增强发光比色纳米探针。

18、步骤六：活化双模态纳米探针：对步骤五的双模态纳米探针进行超声波处理和离心处理，对沉淀物用10～100mm，ph为5.0～7.0的mes溶液洗涤；加入碳二亚胺、n-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀后高速离心，对沉淀物用ph为5.0～7.0的mes溶液洗涤，即得到活化双模态纳米探针。

19、步骤七：制备双模态纳米探针标记crp1/saa 1/pct1/il-6 1/hbp 1单克隆抗体：将步骤六活化后的荧光微球超声波处理1～2min后按照20～200μg/200μl加入crp1/saa1/pct1/il-6 1/hbp 1单克隆抗体，混匀1～3小时，用含0.5％bsa的10～50mm、ph7.0～ph7.5pbs封闭液封闭0.5～1小时后12000～14000rpm高速离心5～15min，用含1％nacl、0.5％bsa、0.1％tween-20的10～50mm、ph7.0～ph7.5 pbs保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；

20、步骤八：制备样品垫：用样品垫处理液在衬底靠近样品垫的一侧平行均匀喷涂两条线，用量为2～4μl液量/cm样品垫，在样品垫靠近包被膜的一侧将双模态纳米探针微球标记的crp1/saa 1/pct1/il-6 1/hbp 1单克隆抗体和兔igg抗体用微球稀释液稀释8～30倍均匀喷涂一条线，用量为2～4μl液量/cm样品垫，置于烘箱中，37℃烘干过夜；所述样品垫处理液为含0.5％nacl、0.5％s17、0.5％bsa、1mg/ml抗rbc抗体的20mm、ph7.4的pbs；所述微球稀释液为含0.5％bsa、20％蔗糖的20mm pbs缓冲液；

21、步骤九：制备包被膜：分别用包被缓冲液将crp1/saa 1/pct1/il-6 1/hbp 1单克隆抗体和羊抗兔igg抗体调整浓度到0.5～2mg/ml，用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，分别作为第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和质控线按照间隔2～4mm的方式平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，然后置于烘箱中，45℃烘干过夜；

22、步骤十：在底衬上沿长度方向顺次相互搭接地粘贴样品垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到检测试纸条。

23、进一步地，所述卡壳包括卡扣连接的塑料下壳和塑料上壳；所述检测试纸条固定在塑料下壳上，检测试纸条的表面通过塑料上壳压紧；所述塑料上壳上对应样品垫和包被膜的位置分别设有加样孔和观察窗。

24、本发明还提供居家自测炎症五项联合检测试剂盒，包括居家自测炎症五项联合检测卡和含有定标曲线的id卡；所述居家自测炎症五项联合检测卡采用上述居家自测炎症五项联合检测卡；所述含有标准曲线的id卡通过检测试纸条测定梯度浓度的校准品，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在id卡中获得。通过干式荧光免疫分析仪可读取居家自测炎症五项联合检测卡上对应的二维码信息并测得相应浓度。

25、本发明还提供上述居家自测炎症五项联合检测试剂盒在pct/il-6/saa/crp/hbp检测中的应用。

26、进一步地，所述居家自测炎症五项联合检测试剂盒定量检测pct/il-6/saa/crp/hbp的方法，包括以下步骤：

27、步骤一，将检测试剂盒和样品置于室温下，待恢复至室温后使用；

28、步骤二，开启稀土纳米荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应id卡；

29、步骤三，用酒精棉片擦拭指尖，用毛细血管吸取10μl血液加入到检测卡加样孔中，随后加入两滴稀释液；

30、步骤四，将检测卡插入检测槽，10min后检测并读取和打印检测结果。

31、上述居家自测炎症五项联合检测试剂盒的检测原理是双抗体夹心法，检测人血清、血浆和全血样本中pct/il-6/saa/crp/hbp的含量。含pct/il-6/saa/crp/hbp的血液样本稀释液滴加在样本加样区，通过毛细作用层析至样品垫，与双模态纳米探针标记的crp1/saa 1/pct1/il-6 1/hbp 1结合，形成微球抗体-抗原复合物，层析至硝酸纤维素膜上检测区，反应复合物被检测线包被的crp2/saa 2/pct2/il-6 2/hbp 2抗体捕获，而多余的荧光微球标记物继续向前层析，兔igg与固定在质控线羊抗兔结合。用光源(980nm)对检测区扫描检测，检测线和质控线上纳米探针发出荧光(540nm)，因为在自然界中不发生上转换过程，因此大大减少了样品自荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。同时含pct/il-6/saa/crp/hbp的血液样本在相应t线会形成一条肉眼可见的绿色条带；检测阴性样本时，检测线(t线)无绿色条带。无论样本中是否存在pct/il-6/saa/crp/hbp，质控线(c线)都会出现一条绿色条带。

32、采用了上述技术方案，本发明具有以下的有益效果：本发明的居家自测炎症五项联合检测试剂盒能够准确定量检测人血液中pct/il-6/saa/crp/hbp的含量，本发明提供的上转换增强发光比色纳米探针兼具纳米银的高吸光度可视比色效果和上转换发光的低背景噪声、高灵敏度的优点，同时引入纳米银用于金属增强荧光，产生于荧光团和纳米银等离子体共振的相互作用，导致金属纳米微粒周围的局域电磁场增强，从而增强激发效率，同时使荧光团的辐射衰变速率亦随之增强，这两方面都共同作用增强荧光团的荧光强度。可居家进行指尖血自测，也可通过仪器进行读值，可快速判断细菌或者病毒感染，避免抗生素滥用。