一种t-PAIC检测试纸、制备方法以及检测试剂盒与流程

本技术涉及免疫检测领域，更具体地说，涉及一种t-paic(组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物)检测试纸、制备方法以及检测试剂盒。

背景技术：

1、组织型纤溶酶原激活剂是血管内皮细胞合成、分泌的单链糖蛋白，可将纤溶酶原转化成为纤溶酶，发挥降解纤维蛋白、凝血因子的作用，确保血管正常畅通性。但血管内皮细胞在生成组织型纤溶酶原激活剂的同时可产生纤溶酶原激活剂抑制物，其主要作用是与组织型纤溶酶原激活剂结合形成组织纤溶酶原激活物—纤溶酶原激活物抑制剂—1复合物(t-paic)，导致组织型纤溶酶原激活剂迅速失活，阻止纤溶酶原激活。因此，外周血t-paic水平越高，纤维蛋白、凝血因子活性越高，血栓形成及冠状动脉狭窄风险越大。

2、经研究发现，在血栓性疾病的发生发展中组织纤溶酶原激活物(t-pa)起到了一定的抑制作用，因此在正常机体中，t-pa呈现为高表达状态。同时，血管内皮细胞还会产生一类拮抗物质纤溶酶原激活物抑制剂(pai)。pai通过与t-pa结合后可加速t-pa的活性失效，从而抑制纤溶酶原的激活。pai-1为pai 4个亚型中的一种，可抑制游离的t-pa。临床上多项研究表明，在冠心病中存在纤维蛋白降解能力下降，而纤维蛋白降解是一个由多种纤溶酶原激活剂与其对应抑制剂之间相互作用产生的结果。pai-1是血浆纤溶活性最重要的一种抑制剂，其水平的提高会促进纤维蛋白的沉积及血栓的形成。

3、在调节以及维持机体纤溶系统平衡过程中，pai-1与t-pa是两个重要因子，机体在正常状态下其循环血液中t-pa与pai-1水平存在一定的平衡，一旦t-pa被释放进入人体血液中会第一时间则被pai-1结合，从而起到了保护血管的完整性以及血管的通畅性。但t-pa与pai-1水平出现失衡，主要表现为pai-1的升高，t-pa含量逐渐降低，而t-paic含量明显升高，从而引发发一系列的病理改变。因此检测血浆中的t-paic可反应纤溶系统的状况。

4、目前，t-paic测定试剂盒基本采用化学发光免疫分析法，该方法灵敏度较好，但试剂稳定性难以控制，且仪器故障率及检测成本高，对检测人员专业性有较高要求。鉴于此，特提出本技术。

技术实现思路

1、为了克服化学发光试剂稳定性难以控制、仪器故障高，对检测人员专业性要求高等缺点，本技术提供一种t-paic、制备方法以及检测试剂盒，使其可以在保证检测准确性和试剂稳定性良好的基础上，进一步缩短了检测时间以及对检测人员专业要求，且试剂的重现性得到了较大的提升。

2、本技术采用如下的技术方案：

3、第一方面，本技术提供一种t-paic检测试纸，其包括依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫；

4、结合垫上涂布有含有阻断剂的封闭液；

5、硝酸纤维膜上设置有检测线和质控线，检测线包被有抗t-paic抗体，质控线包被有质控物质b。

6、进一步地，上述结合垫上还喷涂有分别用荧光微球标记的抗t-paic抗体和质控物质a，质控物质a能够特异性识别质控物质b。

7、进一步地，上述荧光微球的表面修饰有氨基、羧基和羟基中的一种，荧光微球的内部包埋有稀土离子铕、钐、钆、铽和镝中的至少一种。

8、进一步地，上述质控物质a包括鸡igy、兔igg和dnp-bsa中的任一种；质控物质b包括羊抗鸡igy抗体、羊抗兔igg抗体和兔抗dnp-bsa中的任一种。

9、进一步地，上述用荧光微球标记抗t-paic抗体和质控物质a的方法包括：

10、将荧光微球与浓度为15～20mg/ml的nhs溶液混合，然后再加入浓度为15～20mg/ml的edc，反应20～30min后离心去上清，加入偶联缓冲液重悬离心去上清，重复1～2次后，加入偶联缓冲液重悬，加入抗t-paic抗体或质控物质a，旋转反应1～3h后，用bsa进行封闭处理。

11、进一步地，上述检测线包被抗t-paic抗体的方法包括：

12、将浓度为0.6～1.2mg/ml的抗t-paic抗体划线包被于硝酸纤维膜上的检测线，划膜量为0.8～1.2μl/cm。

13、进一步地，上述阻断剂为tru block或动物igg，阻断剂的浓度为0.25～0.45mg/ml。

14、第二方面，本技术还提供一种上述t-paic检测试纸的制备方法，其包括：

15、将抗t-paic抗体包被在硝酸纤维膜的检测线，将质控物质b包被在硝酸纤维膜的质控线，得到含有检测线和质控线的硝酸纤维膜；

16、在结合垫上涂布有含有阻断剂的封闭液；

17、制备样品垫，将样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫依次搭接组装。

18、第三方面，本技术还提供一种t-paic检测试剂盒，其包括试剂卡、样品稀释液和荧光偶联物混合液，试纸卡包括上述检测试纸，荧光偶联物混合液中含有分别用荧光微球标记的抗t-paic抗体和质控物质a，且质控物质a能够特异性识别质控物质b。

19、进一步地，上述样品稀释液中含有表面活性剂和防腐剂；

20、其中，表面活性剂包括triton-100、吐温20、环氧丙烷-环氧乙烷-乙烯基二元胺共聚物、聚氧乙烯月桂醚中的至少一种。

21、综上所述，本技术具有以下有益效果：

22、本技术提供的t-paic检测试纸，包括依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，其中结合垫上涂布有含有阻断剂的封闭液。当采用这种检测试纸时，在检测过程中，需要将荧光偶联物混合液(其包含分别用荧光微球标记的抗t-paic抗体和质控物质a)与待测样品混合充分反应后再滴加到样品垫上。这种方法能够避免喷垫过程造成的活性物质分配不均匀的弊端，且荧光偶联物与样品直接混合反应更加充分，检测的灵敏度和精密度高。

23、本技术也可以在涂布有封闭液的结合垫上进一步喷涂荧光偶联物混合液。采用这种喷涂后的结合垫时，在检测过程中仅需将待测样品滴加到样品垫上即可，由于喷涂在结合垫上的荧光微球偶联物稳定性好，使得该检测试纸的重现性高、且操作方便。

24、本技术采用双抗体夹心法来检测生物样品中t-paic的含量，其检测原理为：测试时，待测样品液(或者将待测样品液与荧光偶联物混合后的反应液)滴加至样品垫上，在毛细效应作用下，从样品垫往吸水垫方向层析，待测样品中存在的t-paic与荧光微偶联物中的用荧光微球标记的抗t-paic抗体结合，形成的荧光微球-抗体-抗原结合物在层析作用下继续迁移至硝酸纤维膜，被检测线的抗t-paic抗体截获，形成复合物聚焦于检测线。同时，荧光微球标记的质控物质a也在层析作用下迁移至质控线被质控物质b截获。在激发光的作用下，荧光微球上的荧光物质发射一定波长的光信号，被荧光免疫层析读卡仪识别，并转化为一定的数值，再根据内置的定标曲线由该数值计算出样品中t-paic的浓度。

25、本技术提供的检测试纸、以及检测试剂盒，采用了荧光免疫分析技术，极大地提高了荧光免疫反应的信号强度和灵敏度，使样品中低含量的t-paic在进行免疫结合时也能产生很强的荧光信号，操作简单稳定性好，无需依赖高昂的仪器，检测成本低，且对检测人员的专业性要求低，有助于血栓等心血管疾病的早期筛选和排查，具有广阔的应用前景。