一种非接触式磷光离子传感材料及其制备和应用方法

本发明属于离子浓度磷光检测，具体涉及一种基于磷光寿命测量的高稳定性、非接触式的磷光离子传感材料及其制备和应用方法。

背景技术：

1、离子检测在科学研究、健康监测、生物医药、农业、水产养殖、水质环保、食品饮品、冶金电镀、地质勘探等领域具有重要的意义。离子选择电极是一种应用广泛的简单、迅速、可实现现场自动连续监测的离子检测分析工具。目前，用于ph和f-、cl-、br-、i-、no3-测定的离子选择电极法已成为国家标准中的检测方法。但在实际应用中，离子选择电极也存在系列问题：首先，共存离子会带来干扰，虽然通过加入掩蔽剂、氧化剂、还原剂、离子强度校准缓冲剂以及调节ph可有效减少甚至消除干扰，但无疑增加了样品前期处理的复杂度和难度；其次，虽然离子选择电极正在向小型化、微型化发展，但是在密闭体系中的实际应用还有诸多问题亟待解决，尤其在细胞治疗和生物医药等新兴的应用场景中，由于溶液体积小、需要密封消毒，离子选择电极的安装、灭菌和防止染菌就成了难题；第三，离子选择电极在使用前需要校准，这增加检测的步骤，在密封消毒的体系中，难以做到电极的及时校准；第四，离子选择电极容易被污染，污染后的电极表面会产生多种氧化还原信号，导致测量选择性、灵敏度和准确度大幅度下降。

2、基于荧光信号变化的离子传感器具有灵敏度高、选择性好、可连续不间断测量、不受电极表面特性影响等优点而得到广泛关注。荧光离子传感器最大的有点在于其非接触式检测的检测模式，可以将荧光传感膜固定在透明的密闭容器器壁上或密闭容器的光学窗口上，容器经过消毒灭菌后，可以将激发光和产生的荧光通过光纤传导的方式传输到测量装置中，实现非接触式测量密闭容器中的离子浓度。荧光离子传感器的测量方式主要有三种：单波长荧光强度检测、双波长荧光强度比率型检测、荧光寿命检测。其中，单波长荧光强度检测与染料浓度相关，且容易受到光源、仪器等因素的干扰而产生波动，以及光漂白会导致荧光强度呈现递减的趋势，因此，该方法无法准确获得荧光分子的荧光强度信息，进而也难以获得待分析物的准确浓度信息。基于双波长荧光强度比率法进行的测量可有效消除荧光染料浓度分布不均带来的影响，由光源和仪器带来的扰动也可以校准，但基于双分子的双波长比率型检测又受到分子光漂白速率差异和负载材料对荧光吸收特性不同的影响，导致测量的稳定性、准确度和可靠性大大下降。荧光寿命检测与染料浓度无关，且不受光源、仪器、光漂白等因素的干扰，仅与染料所处的微环境有关，因而光稳定性良好且准确性好，是一种可用于长期检测的可靠的分析方法，越来越受到研究者的青睐。

3、目前用于离子检测的发光材料主要为有机小分子荧光探针，但是小分子荧光探针存在一定的局限性：第一，光稳定性相对较差，在测量过程中容易发生光漂白而使信号减弱；第二，细胞内的背景荧光会对测定产生干扰，从而影响检测的灵敏度，因而近红外区的探针受到更多的关注；第三，荧光分子的发光特性受分子所处的微环境影响极大，要实现精准的测量，必须保证荧光分子处于统一且稳定的微环境中。而研究表明，将小分子荧光探针负载在载体上构建纳米发光材料可以改善有机小分子的光稳定性(peng,j.,he,x.,wang,k.,tan,w.,wang,y.,liu,y.(2007).noninvasive monitoring of intracellular phchange induced by drug stimulation using silica nanoparticle sensors.analbioanal chem,388(3),645-54.)；其次，通过组装和调控纳米发光材料使其具有较长的荧光寿命，区别于细胞内的纳秒级背景荧光，提高检测的灵敏度；第三，纳米发光材料是将荧光分子与纳米材料连接以阻止荧光分子的泄漏，同时待分析物通过扩散的方式与探针结合进行响应，使荧光分子处于相对统一的微环境中，具有与有机小分子荧光探针同样的响应性能，并且基于荧光寿命的检测不受荧光探针或纳米材料浓度的影响；第四，纳米发光材料可以偶联多种荧光探针，实现多参数测量。

4、目前，基于发光材料的发光寿命测量的离子检测方法仍存在一些问题，主要包括：

5、1)小分子荧光物质的寿命大都在纳秒级，不仅容易受到生物自发荧光的严重干扰，而且需要高频、昂贵的激发光源以及昂贵的单光子计数类仪器来采集信号；2)金属配合物的磷光寿命比较长，但一般没有金属离子响应行为；对配合物的结构进行修饰，使其具有氢离子响应，但这不仅增加了染料制备的难度而且制备探针响应范围不可控，响应浓度范围也难以通过理论模型进行预测，需要大量的合成和测试实验进行验证确认。目前已报道的具有氢离子浓度响应的基于寿命检测的金属配合物组合有以下几种：clarke等人以修饰后的聚合物为载体与钌配合物结合，但得到的传感器响应范围仅为3-5(clarke,y.,xu,w.,demas,j.n.,degraff,b.a.(2000).lifetime-based ph sensor system based on apolymer-supported ruthenium(ii)complex.analytical chemistry,72(15),3468-3475.)；等人在钌配合物的配体上修饰羧基使其具有ph响应，但响应范围仅为2-5(h.m.r.,maule,c.d.,jorge,p.a.s.,esteves da silva,j.c.g.(2008).fiberoptic lifetime ph sensing based on ruthenium(ii)complexes withdicarboxybipyridine.analytica chimica acta,626(1),62-70.)；poehler等人和meier等人分别在钌、铕配合物的配体上偶联荧光素分子，虽然ph检测范围有改善(分别为5-9.5，3-8)，但此类荧光分子的合成和构造较为复杂，且合成的材料光稳定性不好(poehler,e.,pfeiffer,s.a.,herm,m.,gaebler,m.,busse,b.,nagl,s.(2016).microchamber arrayswith an integrated longluminescence lifetime ph sensor.analytical andbioanalytical chemistry,408(11),2927-2935.&meier,r.j.；simbürger,j.m.b.；soukka,t.；m.,(2015).a fret based ph probe with a broad workingrange applicable to referenced ratiometric dual wavelength and luminescencelifetime read out.chemical communications,51(28),6145-6148.)；3)商业化的用于离子检测的磷光发光材料仍属机密，它们的种类和数量相当稀少。因此，开发新型、简便的基于磷光寿命的离子传感器具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种基于磷光寿命测量的高稳定性、非接触式的磷光离子传感材料及其制备和应用方法。本发明的核心思路为将对离子浓度具有响应行为的吸收型指示剂与发射光谱和吸收型指示剂吸收光谱有重叠、光稳定性良好、磷光寿命较长的磷光染料结合在基质载体上，制备成磷光离子传感材料。

2、本发明提供了一种新型的基于磷光寿命测量的光学离子传感新材料，将具有响应离子浓度变化的吸收型指示剂和长寿命的磷光染料进行组合，其中吸收型离子指示剂的吸收光谱与磷光染料的发射光谱具有明显的光谱重叠，当两者被负载在基质载体上，由于两者在空间上接近，两者之间会发生明显的能量转移，从而将具有响应离子浓度变化的吸收光谱信号转变为磷光寿命的变化信号，通过简单易得的相分辨磷光寿命测量技术实现离子浓度的精准测量。具体地：

3、首先，本发明公开了一种非接触式磷光离子传感材料，该材料包括吸收型指示剂和磷光染料，以及用于负载吸收型指示剂和磷光染料的负载材料；吸收型指示剂的吸收光谱与磷光染料的发射光谱存在光谱重叠，从而将吸收型指示剂的吸收光谱变化信号转变为磷光染料的磷光寿命变化信号；磷光寿命变化信号可通过时间分辨或者相分辨测量技术进行精准测量，通过计算得到待测离子的浓度数据；

4、其中：

5、所述的吸收型指示剂为具有离子响应的指示剂，可响应离子包括但不限于氢离子、钠离子、镁离子、铝离子、氯离子、钾离子、钙离子、钴离子、铜离子、锌离子或铅离子；

6、所述的磷光染料包括但不限于钌、铱、铂、钯或铕的金属元素配合物。

7、所述的非接触式磷光离子传感材料的组合，即将氢离子、钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、铝离子、钴离子、铜离子、铅离子、锌离子、氯离子等指示剂与钌、铱、铂、钯、铕等配合物按照光谱重叠的原则(即前者的吸收光谱与后者的发射光谱有部分重叠)进行组合。

8、所述的吸收型指示剂可选择性地响应离子浓度的变化：包括所述的氢离子指示剂为百里酚蓝等指示剂；所述的钠离子指示剂为12-冠-4衍生物等指示剂；所述的镁离子指示剂为酸性铬蓝k等指示剂；所述的铝离子指示剂为二甲酚橙等指示剂；所述的氯离子指示剂为硫氰酸汞等指示剂；所述的钾离子指示剂为15-冠-5衍生物等指示剂；所述的钙离子指示剂为偶氮胂iii等指示剂；所述的钴离子指示剂为二甲酚橙等指示剂；所述的铜离子指示剂为双环己酮草酰二腙等指示剂；所述的锌离子指示剂为双硫腙等指示剂；所述的铅离子指示剂为四-(3,5-二溴-4-羟基苯)卟啉等指示剂。

9、优选地，所述的钌配合物包括以下一种或几种的任意组合：

10、

11、优选地，所述的铂/钯配合物包括以下一种或几种的任意组合：

12、

13、优选地，所述的铕配合物包括以下一种或几种的任意组合：

14、

15、优选地，所述的铱配合物包括以下一种或几种的任意组合：

16、

17、优选地，所述的磷光染料的磷光寿命大于200ns。

18、优选地，所述的负载材料包括有机聚合物材料和无机材料。优选地，所述的负载材料包括聚酯类、表面带有修饰基团的聚烃类有机聚合物材料和无机纳米、微米材料。更优选地，所述的负载材料包括聚氨酯、纤维素和氧化硅纳米颗粒。

19、优选地，所述的吸收型指示剂和磷光染料被负载在负载材料中，吸收型指示剂和磷光染料在空间上接近，从而使得磷光染料和吸收型指示剂之间能够发生能量转移。更优选地，所述的吸收型指示剂和磷光染料结合在一个负载材料上，或结合在不同的负载纳米颗粒上，通过物理溶解负载。更优选地，所述的负载方式为磷光染料被包裹在负载材料内部，保护磷光材料的发光特性不受外界环境因素改变的影响，吸收型指示剂共价连接在负载材料上。

20、一个优选的氢离子传感材料，其中，ph指示剂为百里酚蓝，磷光染料为钌配合物，ph指示剂的吸收光谱与磷光染料的发射光谱重叠：前者的最大吸收光谱范围和后者的最大发射光谱范围分别为600nm±100nm、575nm±50nm。

21、一个优选的钠离子传感材料，其中，钠离子指示剂为12-冠-4衍生物，磷光染料为铱配合物，钠离子指示剂的吸收光谱与磷光染料的发射光谱重叠：前者的最大吸收光谱范围和后者的最大发射光谱范围分别为525nm±15nm、525nm±50nm。

22、一个优选的镁离子传感材料，其中，镁离子指示剂为酸性铬蓝k，磷光染料为铱配合物，镁离子指示剂的吸收光谱与磷光染料的发射光谱重叠，前者的最大吸收光谱范围和后者的最大发射光谱范围分别为540nm±40nm、525nm±50nm。

23、一个优选的铝离子传感材料，其中，铝离子指示剂为二甲酚橙，磷光染料为钌配合物，铝离子指示剂的吸收光谱与磷光染料的发射光谱重叠，前者的最大吸收光谱范围和后者的最大发射光谱范围分别为550nm±50nm、575nm±50nm。

24、一个优选的氯离子传感材料，其中，氯离子指示剂为硫氰酸汞，磷光染料为铱配合物，氯离子指示剂的吸收光谱与磷光染料的发射光谱重叠，前者的最大吸收光谱范围和后者的最大发射光谱范围分别为460nm±30nm、480nm±20nm。

25、一个优选的钾离子传感材料，其中，钾离子指示剂为15-冠-5衍生物，磷光染料为铱配合物，钾离子指示剂的吸收光谱与磷光染料的发射光谱重叠，前者的最大吸收光谱范围和后者的最大发射光谱范围分别为525nm±15nm、525nm±50nm。

26、一个优选的钙离子传感材料，其中，钙离子指示剂为偶氮胂iii，磷光染料为铂/钯配合物，钙离子指示剂的吸收光谱与磷光染料的发射光谱重叠，前者的最大吸收光谱范围和后者的最大发射光谱范围分别为630nm±30nm、650nm±25nm。

27、一个优选的钴离子传感材料，其中，钴离子指示剂为二甲酚橙，磷光染料为钌配合物，钴离子指示剂的吸收光谱与磷光染料的发射光谱重叠，前者的最大吸收光谱范围和后者的最大发射光谱范围分别为550nm±50nm、575nm±50nm。

28、一个优选的铜离子传感材料，其中，铜离子指示剂为双环己酮草酰二腙，磷光染料为铕配合物，铜离子指示剂的吸收光谱与磷光染料的发射光谱重叠，前者的最大吸收光谱范围和后者的最大发射光谱范围分别为600nm±100nm、615nm±5nm。

29、一个优选的锌离子传感材料，其中，锌离子指示剂为双硫腙，磷光染料为铱配合物，锌离子指示剂的吸收光谱与磷光染料的发射光谱重叠，前者的最大吸收光谱范围和后者的最大发射光谱范围分别为540nm±30nm、525nm±50nm。

30、一个优选的铅离子传感材料，其中，铅离子指示剂为四-(3,5-二溴-4-羟基苯)卟啉，磷光染料为铱配合物，铅离子指示剂的吸收光谱与磷光染料的发射光谱重叠，前者的最大吸收光谱范围和后者的最大发射光谱范围分别为475nm±50nm、480nm±20nm。

31、其次，本发明还提供了一种非接触式磷光离子传感材料的制备方法，包括如下步骤：

32、s1、传感材料的选择：选择可响应离子浓度变化的吸收型指示剂；选择发射光谱与吸收型指示剂吸收光谱有重叠、光稳定性良好、磷光寿命大于200ns的磷光染料；选择光学透明、稳定性好的负载材料；

33、s2、传感材料的检测范围调节：通过不同响应性能的吸收型指示剂的选择进行不同的吸收型指示剂与磷光染料的组合，调控离子浓度的检测范围；检测范围可以通过选择已有的响应不同的ph指示剂、金属离子指示剂进行灵活地调节；

34、s3、传感材料的构建：将吸收型指示剂与磷光染料用负载材料负载。优选地，负载方式可结合在单个纳米颗粒上，或通过物理包裹或者共价修饰的方式负载结合在不同的纳米颗粒上。

35、第三，本发明还提供了一种非接触式磷光离子传感材料的应用方法，该方法利用磷光寿命测量/成像系统进行离子浓度的检测/成像，磷光寿命可通过时间相关单光子计数(tcspc)和相位变化测量或磷光寿命显微成像(plim)，从而得到待测离子的浓度数据。进一步，该检测方法是非接触式的，即采用磷光寿命测量/成像系统进行离子浓度的检测/成像，磷光信号经光纤等传导，由探测器或成像系统收集信号，可远程、在线监测。

36、综上所述，本发明具备以下有益效果：

37、(1)吸收型指示剂种类多、检测范围可方便地选择性调节、离子选择性较好，不受光漂白影响、稳定性好，且制备工艺成熟、成本低；所述的离子检测范围可以通过选择已有的响应性能不同的ph指示剂、金属离子指示剂(吸收型指示剂)等进行灵活的调节，不需要设计合成新的或复杂的具有离子响应的染料。

38、(2)磷光染料不需要具有离子响应，大多数的钌、铱、铂、钯、铕等金属元素配合物都满足具有较长磷光寿命的要求；

39、(3)组合的方式简便且多样，具有离子浓度响应的ph指示剂、金属离子指示剂等离子指示剂有很多种，且制备工艺成熟、成本低，因而与磷光染料可以有很多种组合，不仅可以用于不同离子的检测，而且可以调控离子响应的灵敏度；适用的离子种类和浓度检测范围亦多样可变，仅需满足吸收型离子指示剂的吸收光谱与磷光染料的发射光谱具有明显的光谱重叠即可，该方法不仅适用于不同的离子检测，也适用于不同浓度的离子检测。

40、(4)传感材料具有灵敏度高、选择性好、非接触式检测等优点，可用于长期检测且结果可靠，检测方法基于磷光寿命，将吸收信号转化为磷光信号，具有良好的光稳定性，具有不受光源、仪器、光漂白、染料浓度等因素干扰的优点，稳定性良好，适用于长期的检测。

41、综上，该材料具有构建简单、应用范围广、稳定性良好、可用于长期检测、结果可靠等优点，解决了现有荧光离子传感材料稳定性差，测量准确度低、误差大的问题，突破了高性能离子传感材料种类数量稀少的瓶颈问题。基于磷光寿命测量的高稳定性、非接触式的磷光离子传感材料是一种很好的用于离子检测的分析工具。目前，商业化的ph指示剂、金属离子指示剂等离子指示剂种类繁多，且制备技术成熟、成本低，将其与长寿命的磷光染料相结合，制备基于磷光寿命测量的高稳定性、非接触式的磷光离子传感材料具有重要的意义。