一种用于检测单克隆抗体及其类似物糖化水平的硼酸亲和色谱法的制作方法

本发明涉及医药生物检测领域，具体涉及一种硼酸亲和色谱法以用于定量检测单克隆抗体及其类似物的糖化水平。

背景技术：

1、糖化反应是发生在蛋白质氨基基团上的一种非酶催化过程，主要发生在赖氨酸侧链的α-氨基胺和ε-氨基胺末端，与还原糖如葡萄糖、果糖和半乳糖等发生反应。还原糖的醛基可逆的聚集在胺基周围，两个基团间形成一种不稳定的希夫碱中间体，并自发多级amadori重排反应，形成更稳定的氨基酮产物，见图1所示。对于治疗性抗体药物，糖化可能对药物生物学功能和稳定性产生潜在影响。抗体药物糖化反应多发生在发酵过程，细胞培养体系中的葡萄糖是细胞生长代谢的重要能量来源，而已有文献证实抗体的糖化水平和葡萄糖浓度呈正相关；在药物储存过程中，制剂中添加的蔗糖等糖类保护剂可能发生水解形成还原糖，成为抗体糖化反应发生的潜在因素之一，有研究报道抗体的糖化与抗体的聚体含量亦成正相关。近年来，随着对抗体药物的糖化修饰的认识加深，糖化逐渐成为一个潜在的关键质量属性(cqa)。因此需要建立相应的监测手段对糖化部分进行定量。

2、根据抗体药物本身的特性，目前抗体药物的主流糖化检测方法包括液相色谱-质谱法、基于电荷分离的离子交换色谱法和毛细管等电聚焦电泳法、比色法以及硼酸亲和色谱法等。液相色谱-质谱法结合up-down的分析策略，可以在完整或酶切后的亚基水平分析抗体的糖化水平，利用每个糖化位点增加162da的分子量偏移，对糖化水平进行定量。但现有抗体的糖化水平通常不高，而传统的质谱法一方面存在灵敏度较低的局限性，另一方面在实际的生产过程中，质谱仪器使用成本较高，在抗体质量的放行检测中，普及率较低。基于电荷分离的离子交换色谱法和毛细管等电聚焦电泳法均利用抗体糖化后的电荷变化进行检测，理论上抗体发生糖化后，其在上述两种方法中均出现在酸性异构体区域，但除糖化外，酸性异构体的形成因素还包括氧化、脱酰胺、唾液酸修饰等，因此利用电荷差异的分离方法无法单纯的对抗体糖化修饰的变化进行客观定量。比色法利用抗体糖化形成的氨基酮可以被硝基四氮唑蓝还原，利用525nm处的吸光值差进行定量，目前该方法在低糖化水平的抗体药物评价中使用较少。硼酸亲和色谱利用糖的顺式二醇化合物的特点分离抗体的糖化和非糖化部分，是一种相对客观的糖化含量评价方法。

3、该方法在碱性ph的流动相条件下，色谱柱的固定相种硼酸官能团会形成一个阴离子四面体，这个结构可以和糖分子的顺式二醇化合物相互作用而达到分离效果。该方法需要样品量较少，常温下利用普通液相即可实现对抗体的糖化水平进行定量，并且还能将糖化成分收集出来进行其他方面研究，因此目前在实际的抗体药物评价过程中，逐渐受到大家的重视。而现有文献资料报道的硼酸亲和色谱方法为了防止抗体药物与固定相之间的非特异性结合，通常会在流动相(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)中加入掩蔽试剂(tris)和缓冲盐(nacl)，通过优化上述条件，均能达到有效分离糖化成分的效果，典型图谱如图2所示。但是在采用硼酸亲和色谱法分析dupilumab单克隆抗体的糖化异构体时，通过优化tris和缓冲盐浓度无法实现分离的目的。

4、因此，有必要提供一种针对单克隆抗体及其类似物的糖化检测分析硼酸亲和色谱检测方法。

技术实现思路

1、针对以上技术现状，本发明提供一种用于检测单克隆抗体及其类似物糖化水平的硼酸亲和色谱法，所述色谱法包括：流动相含有掩蔽剂，所述掩蔽剂为氨基酸或有机试剂与tris的组合；作为实施方案之一，所述掩蔽剂为氨基酸和tris的组合，作为实施方案之一，所述掩蔽剂为有机试剂和tris的组合。

2、本发明中，作为实施方案之一，所述氨基酸选自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或上述氨基酸衍生物，优选为苯丙氨酸；

3、本发明中，作为实施方案之一，所述有机试剂为乙腈、异丙醇、乙醇或甲醇，优选为异丙醇。

4、本发明中，作为实施方案之一，所述掩蔽剂为氨基酸和tris的组合，流动相中含有(25-100)mm tris、(75-120)mm氨基酸；进一步优选流动相中含有(25-100)mm tris、(75-120)mm苯丙氨酸。

5、作为示例性的说明，流动相中含有25mm、50mm或100mm tris，流动相中含有75mm、100mm或120mm苯丙氨酸。

6、本发明中，作为实施方案之一，所述掩蔽剂为有机试剂和tris的组合，流动相中含有(50-100)mm tris、(5-10)％有机试剂(v/v)；

7、作为实施方案之一，进一步优选流动相中含有(50-100)mm tris、(5-10)％异丙醇。

8、作为示例性的说明，流动相中含有25mm、50mm或100mm tris，流动相中含有5％、6％、7％、8％、9％或10％有机溶剂，例如异丙醇。

9、作为示例性的说明，流动相中含有50mm或100mm tris，5％或10％异丙醇(v/v)。

10、本发明中，作为实施方案之一，所述色谱法包括色谱柱为tskgel boronate-5pwcolumn 7.5mm×75mm。

11、本发明中，作为实施方案之一，所述色谱法包括流动相为：

12、a相：(25-100mm、优选50)mm hepes或epps+(25-100)mm tris+(75-120)mm phe+(100-250mm、优选200)mm nacl，ph8.2-8.7、优选ph8.5；

13、b相：(25-100mm、优选50)mm hepes或epps+(25-100)mm tris+(75-120)mm phe+(100-250mm、优选200)mm nacl+(100-500mm、优选500)mm山梨醇，ph8.2-8.7、优选ph8.5；

14、梯度方法：0-10min，100％流动相a；10.1-25min，100％流动相b。

15、本发明中，作为实施方案之一，所述色谱法包括：柱温：30℃，检测波长：280nm。

16、本发明中，作为实施方案之一，所述色谱法包括流动相为：

17、a相：(25-100mm、优选50)mm hepes+(50-100)mm tris+(5-10)％异丙醇+(100-250mm、优选200)mm nacl，ph8.2-8.7、优选ph8.5；

18、b相：(25-100mm、优选50)mm hepes+(50-100)mm ths+(5-10)％异丙醇+(100-250mm、优选200)mm nacl+(100-500mm、优选500)mm山梨醇，ph8.2-8.7，优选ph8.5；

19、梯度方法：0-10min，100％流动相a；10.1-25min，100％流动相b。

20、本发明中，作为实施方案之一，所述色谱法包括：柱温：30℃，检测波长：280nm。

21、本发明中，作为实施方案之一，所述色谱法包括：单克隆抗体选自dupilumab抗体、或可变区和dupilumab抗体可变区序列同源性高于50％的抗体分子。

22、本发明中，作为实施方案之一，所述色谱法包括：待测样品的制备：取单抗，加入超纯水，混匀，得到浓度为2.5mg/ml的待测样品。

23、本发明中，作为实施方案之一，所述色谱法包括：

24、色谱柱为tskgel boronate-5pw column 7.5mm×75mm；

25、流动相：

26、a相：50mm hepes+(25-100)mm tris+(75-120)mm phe+200mm nacl ph8.5

27、b相：50mm hepes+(25-100)mm tris+(75-120)mm phe+200mm nacl+500mm山梨醇ph8.5

28、梯度方法：0-10min，100％流动相a；10.1-25min，100％流动相b；或

29、a相：50mm hepes+(50-100)mm tris+(5-10)％异丙醇+200mm nacl ph8.5

30、b相：50mm hepes+(50-100)mm tris+(5-10)％异丙醇+200mm nacl+500mm山梨醇ph8.5

31、梯度方法：0-10min，100％流动相a；10.1-25min，100％流动相b；

32、柱温：30℃，检测波长：280nm；

33、待测样品的制备：取单抗，加入超纯水，混匀，得到浓度为2.5mg/ml的待测样品。

34、本发明中所使用的缩写具体含义如下：

35、hepes：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；

36、epps：4-羟乙基哌嗪丙磺酸；

37、tris：三羟甲基氨基甲烷；

38、phe：苯丙氨酸；

39、克服了现有文献报道的方法无法实现dupilumab抗体的糖化水平定量的技术问题，而本发明可以较好的分离该抗体的糖化和非糖化部分，且重复性好、线性及稳定性好；此外，本发明为硼酸亲和色谱方法提供了新的掩蔽剂选择，分别为有机试剂(优选异丙醇)和氨基酸(优选苯丙氨酸)。